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1998-2005年H9N2亚型AIV分离株的生物学特性比较及其NA基因序列分析

作　者: 杨大光
导　师: 王泽霖；王新卫
学　校: 河南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: H9N2 AIV HI 细胞中和试验 抗原漂移 RT-PCR NA基因 克隆 序列分析
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


为了探讨禽流感不同H9N2亚型毒株致病力、抗原性和免疫原性是否在发生漂移,本研究从生物学角度和NA基因分子水平上对1998-2005年间分离到的25株H9N2亚型禽流感病毒进行系统的研究和比较。用有限稀释法对25株鸡源H9N2亚型AIV进行纯化,然后测定各个毒株的TCID50,从中挑选8株有代表性毒株（涵盖不同毒力和分离年代）进行1日龄SPF鸡脑内接种试验（ICPI）,结果显示,TCID50高的18#(10-5.25)、20#(10-4.75)、3#(10-4.25)、23#(10-0.25)毒株均可引起个别雏鸡发病、死亡,ICPI分别为0.437、0.338、0.287、0.238,其它毒株则都为0.000,说明不同毒株对雏鸡的致病力存在着明显差异。用25株H9N2亚型毒株对同一批Hp株抗体作HI试验证实HI值差别可达3log2以上,表明不同H9N2亚型毒株之间抗原性上有明显差别。分别制备上述8个代表株的单因子血清,进行细胞交叉中和试验和HI双交叉试验。细胞中和试验表明98年分离到的3#与99年的6#、00年10#与01年的17#、04年的23#与05年24#毒株的抗原性无明显差异或抗原性相似,相关系数分别为0.71、0.77、0.84;除17#、18#外,1998-2005年各毒株与2005年的24#毒株的相关性呈逐年上升趋势,与1998年的3#毒株的相关性呈逐年下降趋势。HI双交叉试验也取得了类似结果,这说明1998-2005年间,H9N2亚型毒株的抗原性已发生了漂移。选用抗原性、致病性不同的3#、6#、10#、17#、18#、20#（涵盖不同毒力）进行交叉攻毒试验,结果显示,除10#毒株的免疫组不能对18#毒株的攻毒产生完全保护外（保护4/5）,其它毒株疫苗免疫的各组均能对各毒株的攻毒产生交叉保护,均5/5保护。选择抗原性不同的H9N2亚型毒株:15#、18#、23#毒株对同一Hp株制苗免疫的3批鸡作攻毒试验证实Hp株的免疫能对抗原性不同的毒株攻毒产生交叉保护,3个组均保护9/10.两次攻毒保护试验都说明了各毒株间致病性、抗原性有较大差别,但免疫原性变化不大,仍有较强的交叉保护力,现有的疫苗仍能保护鸡群不受流行的流感毒株的威胁。利用RT-PCR技术扩增了上述8个毒株和8#、15#毒株（涵盖所有分离年代和不同毒力）的NA基因,连接到pGEM-T vector上,转化大肠杆菌JM-109,阳性菌液送生物公司测序。NA基因全序列分析表明,所选的10株AIV的NA基因的核苷酸同源性在91.6%～99.9%之间,推导的氨基酸同源性在91.9%～100%之间,这说明中国的鸡源H9N2亚型禽流感病毒的神经氨酸酶基因同源性高,进化稳定。其中3#与6#,10#与23#、24#,15#与17#,23#与24#,8#与A/Chicken/Hongkong/FY20/99的同源性较高、关系较近,系统发育进化树也证明了这一点,同源性比较结果与生物学部分得出的3#与6#,10#与23#、24#,23#与24#抗原性无明显差异的结果较为一致。系统进化树分析表明,10株H9N2病毒的NA基因都属欧亚大陆禽分支,3#和6#属A/Chicken/HongKong/G9/97-like亚分支,其余的8株则都属于A/Chicken/HongKong/Y280/97-like亚分支。尚未发现NA基因属于A/quail/HongKong/G1/97-like亚分支的分离株,与亚洲其他国家如韩国、巴基斯坦的H9N2流感病毒有着明显的进化区别。10个毒株中除3#、6#、8#毒株外在187-195位上均缺失了9个核苷酸。比较10株H9N2毒株NA基因氨基酸序列潜在的糖基化位点和红细胞吸附位点有5个糖基化位点无任何变化,高度保守。17#毒株在38aa-40aa多了一个糖基化位点,而44aa-46aa位的糖基化位点则发生了缺失;10#、20#、23#、24#毒株在264aa-266aa位增加了一个糖基化位点（NIS）;44aa-46aa位糖基化位点有三种（其中3#、6#为NSS,8#、10#、15#、20#、23g、24#为NPS,18#则为NIS）;除3#、6#外,其它毒株61aa-63aa位糖基化位点均发生了缺失。10个H9N2亚型毒株NA的氨基酸红细胞吸附位点（366aa-373aa）有三种情况:3#、6#为IEKDSRSG,8#、15#、17#、18#为IKEDSRSG,10#、20#、23#、24#为IKDDSRSG。10个毒株NA基因上出现的变化尚不能解释这些毒株生物学特性上的差别,另外如糖基化位点的增加或丢失对NA蛋白功能和AIV的致病力有何影响、红细胞吸附位点氨基酸的区别有何作用,都尚待进一步研究。本研究结果不仅从理论上丰富了H9N2亚型禽流感的分子流行病学,而且也为我国政府制定禽流感扑灭政策、有效地防制H9N2提供科学的指导,为生产上H9N2亚型AI免疫与制苗毒株的选择提供参考依据。

全文目录


致谢  4-6
摘要  6-8
文献综述  8-24
试验一 1998-2005年间H9N2 AIV分离株的生物学特性比较  24-40
  引言  24-25
  材料和方法  25-29
  结果与分析  29-38
  结论与讨论  38-40
试验二 H9N2 AIV NA基因的克隆及序列分析  40-78
  引言  40-42
  材料和方法  42-48
  结果与分析  48-75
  结论与讨论  75-78
参考文献  78-86
英文摘要  86-88
附录  88-89

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