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Mineirao柱花草抗炭疽病候选基因MSRA的克隆及其序列分析

作　者: 申建斌
导　师: 蒋昌顺
学　校: 华南热带农业大学
专　业: 植物分子遗传学
关键词: Mineirao柱花草 cDNA末端快速扩增克隆抗炭疽病候选基因序列分析
分类号: S541.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

柱花草(Stylosanthes spp.)是一种优良的热带豆科牧草,原产于中南美洲、北美洲、非洲及东南亚和印度。目前,柱花草已在我国华南热带、亚热带地区进行了大面积种植和推广。然而,柱花草炭疽病的发生和流行限制了柱花草的进一步利用。Mineirao柱花草是一种高度抗炭疽病的品种,已在巴西得到了大面积的推广种植,但其抗病机理尚不清楚。有关研究人员已经对Mineirao柱花草的抗病机理进行了初步研究,并用AFLP分子标记技术从其基因组DNA中获得了一特异片断SG2950-1,经分析,该片断可能是抗炭疽病某一候选基因上的一个中间片断。本论文通过对提取植物组织RNA的CTAB法进行改进,从柱花草叶片中提取得到了高质量的总RNA,成功建立了柱花草叶片总RNA的提取方法。然后根据SG2950-1设计特异引物,利用RT-PCR法结合RACE技术,获得了基因的全长cDNA序列,该序列包含一个长度为1563 bp的开放阅读框,命名为MSRA基因。其推导的氨基酸序列与烟草细胞色素P450一氧化酶有64%的同源性,其预测的蛋白质性质与分子量以及跨膜区等也均与细胞色素P450酶相近,因此,初步预测该基因可能与抗炭疽病有关,但其功能尚待进一步验证。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-10
1 前言  10-31
  1.1 柱花草的重要性  10-11
  1.2 柱花草炭疽病研究进展  11-14
    1.2.1 柱花草炭疽病的主要危害  11-12
    1.2.2 柱花草炭疽病原菌的遗传多态性及流行性研究  12-14
  1.3 柱花草抗炭疽病育种进展  14-16
    1.3.1 收集柱花草种质资源培育抗病品种  14
    1.3.2 引种选育  14-15
    1.3.3 辐射育种  15
    1.3.4 杂交育种  15
    1.3.5 细胞工程育种  15
    1.3.6 转基因抗病育种  15-16
  1.4 柱花草生物学研究  16-17
    1.4.1 柱花草细胞遗传学研究  16-17
    1.4.2 柱花草细胞生物学研究  17
  1.5 柱花草生物技术研究  17-21
    1.5.1 柱花草组织培养  17-18
    1.5.2 柱花草的原生质融合  18
    1.5.3 柱花草遗传转化  18-19
    1.5.4 柱花草分类及分子标记  19-20
    1.5.5 柱花草基因克隆  20-21
  1.6 基因克隆技术进展  21-29
    1.6.1 根据特异蛋白分离目的基因  21
    1.6.2 利用核酸探针克隆目的基因  21-22
    1.6.3 基于分子标记技术分离目的基因  22
    1.6.4 根据特异mRNA 分离目的基因  22-25
    1.6.5 利用DNA 插入法分离目的基因  25-26
    1.6.6 染色体步行法分离目的基因  26
    1.6.7 表达序列标签法分离目的基因  26-27
    1.6.8 基因表达系列分析法  27
    1.6.9 酵母双杂合系统  27
    1.6.10 利用基因芯片技术克隆新基因  27-28
    1.6.11 RACE 技术  28-29
  1.7 本研究的目的和意义  29-30
  1.8 技术路线  30-31
2 材料和方法  31-47
  2.1 植物材料  31
  2.2 菌种和质粒  31
  2.3 培养基  31
  2.4 生化试剂  31-32
  2.5 已知DNA 片断SG2950-1（蒋昌顺，2005）  32
  2.6 引物  32-33
  2.7 主要仪器和设备  33
  2.8 MINEIRAO 柱花草叶片总RNA 的提取  33-35
  2.9 已知片断SG2950-1 的CDNA 克隆  35-40
    2.9.1 反转录生成cDNA 第一链  35
    2.9.2 反转录产物的检测  35-36
    2.9.3 PCR 反应  36-37
    2.9.4 RT-PCR 产物的切胶回收  37-38
    2.9.5 克隆片断连接T 载体  38
    2.9.7 连接产物转化E. coil JM 109 感受态细胞  38-39
    2.9.8 重组质粒的鉴定  39
    2.9.9 测序及序列分析  39-40
  2.10 MSRA 基因3′端未知序列的克隆  40-42
    2.10.1 所用引物  40
    2.10.2 反转录生成cDNA 第一链  40
    2.10.3 PCR 反应  40-42
    2.10.4 将PCR 产物克隆至载体进行测序分析  42
  2.11 MSRA 基因5′端未知序列的克隆  42-45
    2.11.1 所用引物  42
    2.11.2 反转录生成cDNA 第一链反应  42-43
    2.11.3 反转录产物的加A 反应  43-44
    2.11.4 PCR 反应  44-45
    2.11.5 将PCR 产物克隆至T-载体进行测序分析  45
  2.12 MSRA 基因全长 CDNA 序列的 RT-PCR 克隆  45-47
    2.12.1 引物的设计  45-46
    2.12.2 PCR 反应  46
    2.12.3 将PCR 产物克隆至T-载体进行测序分析  46-47
  2.13 数据分析  47
3 结果与分析  47-61
  3.1 MINEIRAO 柱花草叶片总RNA 质量分析  47-48
  3.2 反转录CDNA 的质量检测  48
  3.3 MSRA 基因的克隆  48-55
    3.3.1 Mineirao 柱花草中已知片断 SG2950-1 的cDNA 克隆  48-49
    3.3.2 MSRA 基因的cDNA 3′端未知序列的克隆  49-51
    3.3.3 MSRA 基因的cDNA 5′端未知序列的克隆  51-52
    3.3.4 3 个片段的cDNA 序列（MSRA-1，MSRA-3′，MSRA-5′）的拼接及其拼接序列的分析  52-53
    3.3.5 MSRA 基因cDNA 全长序列的克隆  53-55
  3.4 MSRA 基因所推导的氨基酸序列的功能预测  55-61
    3.4.1 MSRA 基因所推导的氨基酸序列的同源性比较  55-57
    3.4.2 MSRA 基因的蛋白质理化性质分析  57-58
    3.4.3 跨膜区预测  58-59
    3.4.4 MSRA 基因的氨基酸序列的二级结构预测  59-61
4 讨论  61-64
  4.1 MINEIRAO 柱花草叶片总RNA 的提取  61
  4.2 MSRA 基因的克隆  61-62
  4.3 细胞色素P450 酶系的存在和基本功能  62-64
    4.3.1 细胞色素P450 酶系存在的普遍性  62
    4.3.2 植物细胞色素P450 酶系的基本功能  62-63
    4.3.3 植物细胞色素P450 酶系的可诱导性  63-64
5 结论  64-65
参考文献  65-73
缩略词（ABBREVIATION）  73-75
附录：硕士期间发表论文情况  75-76
致谢  76

Mineirao柱花草抗炭疽病候选基因MSRA的克隆及其序列分析

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