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兔病毒性出血症病毒YL株VP60基因的克隆与生物信息分析及原核表达与转化串叶松香草研究

作　者: 李传山
导　师: 郭蔼光
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 兔出血症病毒(RHDV) 衣壳蛋白(VP60)基因生物信息原核表达植物遗传转化
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 109次
引　用: 3次
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内容摘要

兔出血症(Rabbit Hemorrhagic Disease, RHD)是由兔出血症病毒(Rabbit Hemorrhagic Disease virus, RHDV)所致的兔的一种急性、高度传染性、高度致死性的疾病,以兔全身实质器官水肿、淤血及出血性变化为主要特征。其发病率和致死率都很高,被感染的成年兔基本上在48~72 h内死亡,是兔的一种毁灭性传染病。该病自1984年于中国江苏省首先暴发后迅速流行蔓延开,迄今为止,中国的几乎所有省份都有RHDV流行的报道,在国外各养兔地区也存在和流行,是养兔业的严重威胁。为了研究西北地区的RHDV分子生物学特征和RHDV病毒流行规律,我们应用RT-PCR方法从RHDV西北分离株YL中克隆出衣壳蛋白VP60基因并测序,测序结果显示VP60基因全长1 740 bp,编码579个氨基酸,序列在GenBank中注册(登录号为DQ530363)。YL株是中国西北地区首株被测序的RHDV。从GenBank里下载全部已发表的其它39株RHDV序列,运用生物信息学软件分析,构建系统进化树和氨基酸序列同源性表,结果表明世界不同地区RHDV分离株基因序列虽然非常保守,达到90 %以上,但可以分为5个基因群,并且基因型和地域性没有必然联系,中国的分离株除了WX84株外,其它均处于第V基因群,该基因群内近年分离出的中国四个不同大地区(西北、华东、东北、西南)的RHDV毒株与NJ85株遗传距离很近,很可能都来自同一毒株NJ85。同时,对四个不同大地区的近年的四个代表性分离株的二级结构、抗原性进行了预测分析,结果显示二级结构有一定差异,但抗原性相同,这与RHDV只有一个血清型相一致。同时为在原核中高效表达兔出血症病毒(RHDV)VP60衣壳蛋白,以研究RHD亚单位疫苗,我们构建了YL株VP60基因原核表达载体VP60-pET32a,转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析显示,VP60融合蛋白分子量为75 kD,其占总菌体蛋白的表达量达39.8 %。Western blot分析表明,VP60融合蛋白可以和RHDV TP株抗血清特异反应。本研究显示兔出血症病毒在干旱半干旱条件下的遗传变异和免疫学特征没有较大变化。我们通过对串叶松香草不同激素浓度配比的诱导分化实验,建立了串叶松香草离体培养高效再生体系,结果表明MS+6-BA(2.0mg/L)+NAA(0.1mg/L)培养基可高效诱导愈伤组织和芽的分化,1/2MS+IBA(0.1mg/L)培养基可快速诱导根的生成,形成再生植株。构建了植物表达载体VP60-pBI121,利用根癌农杆菌介导叶盘法转化串叶松香草以研究高效的串叶松香草转化体系,结果显示以农杆菌LBA4404为介导菌株、以叶片为转化外植体、3 d预培养时间和3~4 d共培养时间、400 mg/L羧苄青霉素和40 mg/L卡那霉素筛选浓度转化效果较好,在这种转化体系中,我们筛选到了两株VP60拟转基因植株,为利用串叶松香草生产兔出血症病毒动物基因工程疫苗奠定了技术基础

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-10
第一章文献综述  10-32
  1.1 兔出血症病毒及其疫苗的研究进展  10-17
    1.1.1 兔出血症病毒概述  10-14
    1.1.2 兔出血症病毒疫苗的研究进展  14-16
    1.1.3 兔出血症病毒疫苗的应用前景  16-17
  1.2 植物基因工程疫苗研究进展  17-27
    1.2.1 植物基因工程疫苗及可食用疫苗概述  17-18
    1.2.2 植物基因工程疫苗的原理及研究进展  18-23
    1.2.3 植物基因工程疫苗的优缺点和应对策略及发展前景  23-27
  1.3 根癌农杆菌介导的植物遗传转化  27-30
    1.3.1 根癌农杆菌介导的遗传转化机制  27-29
    1.3.2 根癌农杆菌介导的遗传转化方法  29-30
  1.4 串叶松香草研究概况  30-31
  1.5 本研究的目的和意义  31-32
第二章 YL 株衣壳蛋白(VP60)基因的克隆和生物信息分析  32-47
  2.1 材料  32-33
    2.1.1 病毒材料  32
    2.1.2 质粒与菌株  32
    2.1.3 试剂和仪器  32-33
    2.1.4 培养基与溶液  33
    2.1.5 PCR 引物  33
  2.2 方法  33-39
    2.2.1 引物设计  33
    2.2.2 病毒RNA 的提取  33-34
    2.2.3 病毒VP60 基因的反转录(RT)和PCR  34-35
    2.2.4 RT-PCR 产物的克隆及测序  35-37
    2.2.5 VP60 基因的生物信息学分析  37-39
  2.3 结果与分析  39-45
    2.3.1 YL 株RHDV 基因组RNA 的提取  39
    2.3.2 YL 株VP60 基因的扩增  39
    2.3.3 重组质粒的鉴定  39-40
    2.3.4 YL 株VP60 基因的序列测定和编码蛋白分子特征  40
    2.3.5 RHDV VP60 基因的生物信息分析  40-45
  2.4 讨论  45-46
  2.5 小结  46-47
第三章兔出血症病毒YL 株衣壳蛋白VP60 基因在原核系统中的高效表达  47-56
  3.1 材料  47-48
    3.1.1 质粒与菌株  47
    3.1.2 主要试剂和仪器  47
    3.1.3 培养基与主要溶液  47-48
    3.1.4 PCR 引物  48
  3.2 方法  48-51
    3.2.1 VP60 基因表达质粒的构建与转化  48-49
    3.2.2 VP60 的诱导表达  49
    3.2.3 重组表达VP60 的SDS-PAGE 检测  49-50
    3.2.4 Western blot 检测  50-51
  3.3 结果与分析  51-55
    3.3.1 原核表达载体VP60-pET32a 的构建  51-52
    3.3.2 VP60-pET32a 的鉴定  52
    3.3.3 VP60 的表达和SDS-PAGE 检测  52-53
    3.3.4 重组表达VP60 的Western blot 免疫反应  53-55
  3.4 讨论  55
  3.5 小结  55-56
第四章串叶松香草高效再生体系的建立与外壳蛋白基因VP60 的遗传转化  56-67
  4.1 材料  56-57
    4.1.1 植物材料及质粒与菌株  56
    4.1.2 主要试剂和仪器  56
    4.1.3 培养基与主要溶液  56-57
    4.1.4 PCR 引物  57
  4.2 方法  57-60
    4.2.1 再生体系的建立  57-59
    4.2.2 植物表达载体VP60-pBI121 的构建及对农杆菌的转化  59-60
    4.2.3 遗传转化体系的建立  60
  4.3 结果与分析  60-64
    4.3.1 串叶松香草高频再生培养基的筛选  60-61
    4.3.2 植物表达载体VP60-pBI121 的构建  61-63
    4.3.3 串叶松香草遗传转化体系的建立  63-64
  4.4 讨论  64-66
  4.5 小结  66-67
结论  67-68
参考文献  68-76
附录  76-79
致谢  79-80
作者简介  80

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