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ats1A启动子驱动的兔出血症病毒外壳蛋白VP60基因的植物表达载体构建及百脉根的转化

作　者: 王涛
导　师: 郭蔼光
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: Rubisco(1，5-二磷酸核酮糖羧化酶) 兔出血症病毒(RHDV) 外壳蛋白(VP60)基因 ats1A启动子 植物双元表达载体
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 27次
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内容摘要


Rubisco即1 , 5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶,是调节光合CO 2固定的关键酶,也是植物可溶性蛋白质中含量最高的。大多数真核和原核生物Rubisco的8个大亚基( rbcL,50～60kD)是由叶绿体DNA编码、叶绿体核糖体翻译;8个小亚基( rbcS,12～18kD)是由核DNA编码、细胞质核糖体翻译,拟南芥的rbcS基因包括ats1A、ats1B、ats2B和ats3B,ats1A启动子包括转运肽(transit peptide)序列,利用其转运肽将外源基因产物定位到叶绿体中可提高其积累水平,也是提高外源基因表达量的一种有效策略。兔出血症(rabbit hemorrhagic disease, RHD)俗称“兔瘟、兔出血热”。是由兔出血症病毒(rabbit hemorrhagicdisease virus, RHDV)所致兔的一种急性、高传染性、高致死性疾病,以全身实质器官水肿、淤血及出血性变化为主要特征,其发病率和致死率都很高,是兔的一种毁灭性传染病。RHDV衣壳蛋白VP60与诱导抗病毒感染的免疫反应直接相关,是病毒免疫保护性抗原。RHDV只有一个血清型,注射疫苗是预防RHD的最有效方法,但由于RHDV迄今未能稳定地适应于任何细胞培养,现行疫苗只能用感染RHDV致死的兔肝脾组织制备组织灭活疫苗,存在着诸多弊端,而用VP60制备RHD亚单位疫苗是一个新的途径。本实验目的是利用植物基因工程技术,结合机体免疫机理(有效地诱导机体产生粘膜免疫和系统免疫反应),生产出使兔子食后产生抗RHDV外壳蛋白VP60的转基因百脉根。实验中,为了使VP60蛋白能定位在百脉根叶绿体中,稳定表达,选用拟南芥Rubisco小亚基ats1A启动子(包括其转运肽),构建了以植物表达载体pCAMBIA1300为基础,ats1A启动子驱动的vp60的植物双元表达载体。首先,利用PCR扩增拟南芥atslA基因启动子成功的构建载体pCAMBIA1300-ats1A;其次,PCR扩增vp60,成功构建了载体pBin438-vp60;最后,利用pBin438终止子Nos-T连接的VP60基因,与pCAMBIA1300-ats1A成功构建了用于转化百脉根的植物双元表达载体pCAMBIA1300-ats1A-vp60。在植物遗传转化方面,以百脉根下胚轴愈伤组织为转化受体,利用根癌农杆菌( Agrobacterium tumefaciens) GV3101侵染、300mg/L羧苄霉素抑菌和30mg/L潮霉素进行抗性植株的筛选,并已筛选到十几株拟转基因植株,为利用百脉根生产兔出血症病毒动物口服疫苗以及利用ats1A启动子叶绿体转运肽作用来驱动外源基因在植物受体中的表达建立了初步的技术基础。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-10
第一章 文献综述  10-31
  1.1 RUBISCO 小亚基基因及其转运肽研究概况  10-15
    1.1.1 RbcL 与rbcS 研究概述  10-11
    1.1.2 转运肽——引导蛋白转运和定位的信号  11
    1.1.3 转运肽的性质、结构和功能  11-12
    1.1.4 前体在叶绿体中的加工  12-15
  1.2 兔出血症病毒及其疫苗的研究进展  15-19
    1.2.1 兔出血症病毒（RHDV）概述  15-16
    1.2.2 兔出血症病毒疫苗的研究进展  16-19
    1.2.3 兔出血症病毒疫苗的前景  19
  1.3 转基因植物疫苗研究进展  19-25
    1.3.1 转基因植物疫苗及口服疫苗概述  20-21
    1.3.2 转基因植物口服疫苗的免疫机制  21-22
    1.3.3 转基因植物疫苗研究进展  22-23
    1.3.4 转基因植物疫苗的优缺点和应对策略  23-25
  1.4 根癌农杆菌介导的植物遗传转化  25-29
    1.4.1 根癌农杆菌介导的遗传转化机制  25-28
    1.4.2 根癌农杆菌介导的遗传转化方法  28-29
  1.5 百脉根概况  29-30
  1.6 本研究的目的和意义  30-31
第二章 ATS1A 启动子驱动的VP60 基因的植物表达载体构建  31-39
  2.1 材料  31-32
    2.1.1 质粒与菌株  31
    2.1.2 主要试剂和仪器  31
    2.1.3 培养基与溶液  31-32
    2.1.4 PCR 引物  32
  2.2 方法  32-35
    2.2.1 引物设计  32
    2.2.2 克隆含PstI、XbaI 双酶切位点的载体p18T-ats1A 以及植物表达载体pCAMBIA1300-ats1A 的构建  32-34
    2.2.3 克隆含XbaI、SacI 双酶切位点的载体p18T-vp60 以及中间载体pBin438-vp60的构建  34-35
    2.2.4 构建ats1A 启动子驱动的RHDV 外壳蛋白（VP60）的植物双元表达载体（pCAMBIA1300-ats1A-vp60）  35
  2.3 结果与分析  35-38
    2.3.1 载体构建路线  35-36
    2.3.2 植物表达载体pCAMBIA-1300-ats1A 的鉴定  36-37
    2.3.3 中间载体pBin438-vp60 的鉴定  37-38
    2.3.4 植物双元表达载体pCAMBIA1300-ats1A-VP60 的鉴定  38
  2.4 讨论  38-39
第三章 RHDV 外壳蛋白基因VP60 转化百脉根  39-45
  3.1 材料  39
    3.1.1 植物材料及质粒与菌株  39
    3.1.2 主要试剂和仪器  39
    3.1.3 培养基与主要溶液  39
    3.1.4 PCR 引物  39
  3.2 方法  39-42
    3.2.1 植物组织培养培养基  39-40
    3.2.2 植物表达载体pCAMBIA1300-ats1A-VP60 对农杆菌的转化  40-41
    3.2.3 遗传转化体系的建立  41-42
  3.3 结果与分析  42-43
    3.3.1 根癌农杆菌菌落PCR 检测  42-43
    3.3.2 百脉根遗传转化  43
  3.4 讨论  43-45
第四章 结论与创新  45-47
  4.1 结论  45
  4.2 创新  45-47
参考文献  47-56
附录  56-59
致谢  59-60
作者简介  60

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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