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新的白血病相关基因LRP15的克隆及其功能的初步研究

作　者: 徐周敏
导　师: 于力；楼方定
学　校: 中国人民解放军军医进修学院
专　业: 血液内科
关键词: LRP15 基因克隆 RACE 白血病相关候选基因生物信息学蛋白定位甲基化 K562细胞 MS-PCR 5-杂氮-2’-脱氧胞嘧啶曲古抑菌素
分类号: R733.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

急性白血病的发生包括了复杂的基因突变、缺失、癌基因激活及抑癌基因失活等多种分子生物学水平的异常，寻找新的白血病相关基因一直是这一领域的研究热点，不仅有助于阐明白血病发生发展的机制，而且可能找到一些治疗靶位点。为克隆与白血病复发相关的新基因(LRP15)的全长cDNA序列，我们应用先进的分子生物学及生物信息学技术对一段已知仅在白血病复发标本中被甲基化的1.8kb长的DNA片段进行研究分析，通过在美国生物信息中心(NCBI)提供的hEST数据库中电子杂交并对相互重叠的EST片段组装、设计引物进行cDNA末端快速扩增。以高通量基因组序列(HTGS)数据库及SAGE文库为基础，将获得的cDNA片段进行染色体定位及组织表达分析。结果克隆到了LRP15基因的全长cDNA序列(1718bp)，含一个780bp的开放读码框架，编码259个氨基酸，定位于染色体3p24，在多种组织中表达。为进一步研究该基因的功能奠定了基础。通过对新基因的生物信息学分析，表明LRP15基因是一个与人类急性白血病及其他肿瘤发生、发展密切相关的基因。为进一步阐明新基因LRP15编码蛋白质的功能，确定编码蛋白质的亚细胞定位。我们利用生物信息学方法，以人类基因组资源(HGR)数据库为基础，进行LRP15启动子区特征分析。在Prosite数据库中进行有生物学意义的保守性氨基酸修饰位点搜索。通过RPS-BLAST程序预测其蛋白质结构及功能。以增强绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因，利用激光共聚焦显微镜等实验方法验证生物信息学的分析结果。结果表明，LRP15编码蛋白含有cAMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点及酪蛋白激解放军总医院军医进修学院硕士论文酶H磷酸化位点，其N端有一个富含亮氨酸重复序列。L RPRP15编码蛋白定位于细胞核内。提示 LRP是一个核蛋白困子，其功能可能是参与细胞的生长分化，调节细胞周期，细胞的发育调控或 DNA修复。也从另一个侧面证实了生物信息学预测基困功能的真实性。为进一步从实验上证实该基因的表达是否与白血病的发生发展相关，我们选择正常成人外周血（NP B）、正常骨髓（NB M）、经G－CSF动员的正常外周血干细胞（N－PBSC）、原代白血病细胞及白血病细胞系为研究对象，采用 RTPCR 方法分别检测了LRP基因的表达水平；从研究白血病细胞系K562中LRP 启动子区CpG岛甲基化状况出发，应用甲基化产P制剂5－杂氮上－脱氧胞喀嚏（5－aza－2’－deoxycytldine、decitabine、CdR）及去乙酞化酶抑制剂曲古抑菌素（Trichostatin，TSA）诱导帅G岛去甲基化及组蛋白乙酞化，观察启动子区CpG 岛甲基化状况与基因表达的关系，以确定LRP15基因在肿瘤细胞中的表达是否受甲基化的调控。结果显示，L yy15在NP B中的阳性率明显低于NB M、 NPBSC，两者相比有显著。性差异（p－0．005 L 与 NPB相比，后两者均含有丰富的幼稚造血细胞。AML与 ALL相比；LRP表达的阳性率无明显差异，但在 AML中，粒系白血病 LRP表达阳性率明显高于单核系白血病，两者有显著性差异（尸一0刀02＊而且，在4例表达阳性的＊u中，有2例带有髓系标志。提示该基困可能与造血细胞的发育相关，在幼稚粒系细胞中表达水平较高，对急性白血病的临床分型具有重要的意义。在AML中，难治组和初治组的阳性率分别为 1000和 57．l0；在 ALL中，难i台组和初i台组的 F日性率分别为 60％和20％。难治组L RPRPIS表达的阳性率有高于初治组的趋势。表明L RPRP15基因可能在急性白血病的预后中具有一定价值。我们通过MS－PCR技术检测LM15 基因启动子区的甲基l匕状况，证实了白血病细胞系K562中Lnyls基困启动子呈高甲基化状态，并抑制了该基因的表达。单独应用或联合 TSA应用 CdR均可去除该基因启动子区的高甲基化状态，并诱导该基因的表达。证实了LW 基固在K562细胞中的表达受到甲基化的调控。通过对LRP15基因在K562细 6 解放军总医院军医进修学院硕士论文胞系中甲基化和表达的关系的研究，可以认为，Lny 5基因的表达受到启动子区甲基化的调控；该基因在K562细胞系中不表达与其启动子区高甲基化及组蛋白去乙酞化密切相关。提示甲基转移酶抑制剂与去乙创匕酶抑制齐］在白血病治疗中具有一定的价值。

全文目录

英文缩略语  5-6
中文摘要  6-9
英文摘要  9-12
第一部分：新的白血病相关基因LRP15全长cDNA的克隆  12-40
  前言  12
  材料方法  12-22
  结果  22-33
  讨论  33-37
  参考文献  37-40
第二部分： LRP15基因的功能预测及其编码蛋白在细胞内定位的实验研究  40-55
  前言  40
  材料方法  40-47
  结果  47-51
  讨论  51-53
  参考文献  53-55
第三部分： LRP15基因在原代白血病细胞、白血病细胞系中的表达及其启动子区甲基化的关系研究  55-73
  前言  55
  材料方法  55-60
  结果  60-66
  讨论  66-70
  参考文献  70-73
结论  73-74
综述： DNA甲基化与白血病的研究进展  74-80
参考文献  80-82
致谢  82-84
发表文章  84

新的白血病相关基因LRP15的克隆及其功能的初步研究

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