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猪瘟兔化弱毒编码E2囊膜糖蛋白A/D抗原区基因的原核表达和重组蛋白的初步应用

作　者: 苏小运
导　师: 李劲松；陈溥言
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪瘟兔化弱毒原核表达 E2 A/D抗原区间接ELISA
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

本文利用不同大肠杆菌表达系统(所用表达载体分别为：pThioHisB和pET-32a(+))表达了猪瘟兔化弱毒编码E2蛋白A／D抗原区的基因，并对其表达特性进行了比较。选取含pET-E2HA重组质粒的BL21(DE3)，即BL21E2HA大量表达重组蛋白，通过盐酸胍溶解，通过His Bind柱纯化了重组蛋白，定量并以其为包被抗原建立了间接ELISA方法。利用此方法测定了约150份囊素与猪瘟兔化弱毒疫苗共同免疫猪血清的猪瘟抗体水平；比较了此方法和间接血凝试剂盒测定猪瘟抗体水平的灵敏度。主要实验内容包括： 1．构建了两株重组质粒：pTH-E2和pET-E2，所用表达系统分别为pThioHisB和pET-32a(+)，优化了表达条件并比较了两种质粒的表达特性，发现pET系统在表达此段基因时产量明显优于pThioHisB系统； 2．选择pET-E2进行后继工作：将3个串联的HA(人血凝素表位)基因插入到pET-E2重组质粒的BamHⅠ和HindⅢ位点之间，得到pET-E2HA重组质粒，含有此质粒的BL21(DE3)命名为BL21E2HA，并将其成功的表达； 3．利用BL21E2HA大量表达重组蛋白，将细菌裂解，超声波破碎、离心分离包涵体，盐酸胍溶解后过His Bind柱，纯化了重组蛋白； 4．利用BSA制备标准曲线，并对处于不可溶状态的纯化后重组蛋白进行了定量。在此基础上，用其作包被抗原建立了间接ELISA方法；利用此间接ELISA方法，测定了约150份囊素与猪瘟兔化弱毒疫苗共同免疫猪血清的猪瘟抗体水平，发现经囊素共同免疫后，猪瘟抗体水平有明显提高，这从另一方面证明，该方法具有一定的实用价值，可以进行猪瘟抗体水平的测定； 5．比较了间接ELISA方法和现有的间接血凝试剂盒测定猪瘟抗体水平时的灵敏度，发现该方法明显优于后者。 6．构建了一个用以检测在细胞培养上猪瘟病毒粒子存在的重组质粒。

全文目录

中文摘要  5-6
英文摘要  6-7
第一章文献综述  7-22
  第一节猪瘟病毒的分子生物学研究进展  7-18
    一. 分类  7-8
    二. 病毒形态与结构  8
    三. 基因组与其编码的蛋白质  8-14
    四. 病毒复制、进化和分子流行病学  14-18
  第二节猪瘟的诊断方法  18-22
    一. 动物接种试验  18
    二. 血清学试验  18-20
    三. 分子生物学诊断  20-21
    四. 其它方法  21-22
第二章含编码猪瘟病毒兔化弱毒株E2蛋白A／D抗原区基因的不同原核表达载体的构建及表达初步研究  22-45
  一. 材料和方法  23-32
  二. 结果  32-34
  三. 讨论  34-45
第三章含编码3个串联的HA抗原表位基因的pET-E2HA重组质粒的构建以及重组蛋白的纯化  45-56
  一. 材料和方法  46-51
  二. 结果  51-52
  三. 讨论  52-56
第四章以E2HA重组蛋白为包被抗原间接ELISA方法的建立及其初步应用  56-67
  一. 材料和方法  56-59
  二. 结果  59-62
  三. 讨论  62-67
第五章用以检测细胞培养中猪瘟病毒粒子存在重组质粒的构建  67-72
  一. 材料和方法  67-69
  二. 结果  69
  三. 讨论  69-72
参考文献  72-79
全文总结及攻读硕士学位期间发表的学术论文  79-80
致谢  80

猪瘟兔化弱毒编码E2囊膜糖蛋白A/D抗原区基因的原核表达和重组蛋白的初步应用

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