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大蒜素联合奥沙利铂对HCT-8细胞生长的影响及机制探讨

作　者: 崔瑞雪
导　师: 王贵吉
学　校: 郑州大学
专　业: 肿瘤学
关键词: 大蒜素奥沙利铂大肠癌细胞周期凋亡
分类号: R73-3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

背景与目的:随着人们生活方式和膳食结构的改变以及人口的老龄化,大肠癌的发病率有逐年上升的趋势。目前大肠癌占恶性肿瘤的10%～15%,且全球大肠癌发病率仍以2%的速度递增。在我国,近年来大肠癌发病率增加较快,尤以大城市显著。据统计,大于30%的病人在临床诊断时已属转移性大肠癌。手术病例中早期大肠癌不足5%,大肠癌根治术后50%以上的病人在5年内复发。对于复发或转移性大肠癌,化疗在其综合治疗中应占重要地位。奥沙利铂是大肠癌术后辅助化疗及部分晚期大肠癌姑息化疗的一线药物。但是奥沙利铂突出的累积剂量相关的毒副反应如慢性周围神经毒性限制了其临床长期应用。所以需要寻找一种能增强奥沙利铂抗肿瘤作用而本身无明显毒副作用的药物。大蒜素是从大蒜球茎提取出来的一种含硫化合物,化学名为二烯丙基三硫化物（DiallylTrisulfide,DATS）,被誉为天然广谱抗生素药物。除抗炎作用外,大蒜素还具有抗衰老、降血脂、降血压、抗凝血、抗病毒等作用。近年研究发现大蒜素对肿瘤细胞具有抑制细胞生长、调节细胞周期、促进细胞凋亡及直接杀伤肿瘤细胞等作用。研究还表明大蒜素不仅可以通过调节机体免疫功能以干扰肿瘤的生长以还可以与化疗药物合用起到化疗增敏作用。国内外有大蒜素联合紫杉醇、长春新碱或顺铂作用于宫颈癌、前列腺癌、食管癌及胃癌等细胞的报道,但大蒜素与奥沙利铂联合作用于大肠癌的报道鲜见。为研究大蒜素与奥沙利铂单独及联合应用对大肠癌HCT-8细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响并初步探讨其机制,本实验把大蒜素和奥沙利铂单独及联合作用于HCT-8细胞,通过MTT法及流式细胞术检测了两药单用及联合应用对HCT-8细胞的分裂增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响,进一步通过免疫细胞化学方法从蛋白分子水平检测细胞凋亡情况。这为临床联合应用大蒜素与奥沙利铂以减少奥沙利铂的应用剂量并进而减少其累积剂量相关性毒副反应的发生率、提高肿瘤细胞对奥沙利铂的敏感性提供了实验依据。材料与方法:1.细胞复苏与培养。常规复苏冻存的HCT-8细胞,培养在含有10%标准胎牛血清的RPMI-1640培养液中,于37℃、5%CO₂饱和湿度培养箱内。每2-3天消化传代。2.MTT法检测不同浓度的大蒜素、奥沙利铂对HCT-8细胞24、48、72h的增殖抑制率（IR）、并计算各药物对HCT-8细胞24h的半数抑制浓度IC₅₀。药物对细胞的生长抑制率:IR（%）=（1-实验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%。3.MTT法检测大蒜素联合奥沙利铂对HCT-8细胞的增殖抑制作用。分组为大蒜素组、奥沙利铂组、联合用药组、对照组和调零组,作用时间为24h。4.倒置显微镜下观察药物作用前及作用24、48、72h后细胞形态的变化。5.流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡。HCT-8细胞用无血清培养基培养24 h,使细胞生长同步化,之后常规培养。细胞贴满瓶底70%时分组:大蒜素组、奥沙利铂组、联合用药组和对照组。处理因素作用24h后终止。各组细胞收集后取一部分及时上机检测细胞凋亡,另一部分经冰乙醇固定过夜后上机检测细胞周期。6.免疫组化法检测caspase-3的表达。取对数生期的HCT-8细胞,加入已放置盖玻片的24孔板中,细胞贴满瓶底70%时分组处理。分组处理及作用时间同凋亡检测。采用免疫细胞化学SP法DAB检测系统检测caspase-3的表达。结果判定:caspase-3阳性细胞胞浆/胞核出现棕黄色颗粒,以胞浆为主。结果:1.大蒜素和奥沙利铂单独作用于HCT-8细胞后,与对照组比较,增殖抑制率均升高（均为P＜0.01）,并且大蒜素和奥沙利铂对HCT-8细胞的增殖抑制作用随药物浓度的增加及作用时间的延长而增加。2.大蒜素和奥沙利铂对细胞生长的协同抑制效应。联合用药组的细胞生长抑制率较各单药组明显增加,差异均具有统计学意义（均为P＜0.01）,两药合用表现为协同作用:q=1.27,P＜0.05。3.对照组细胞生长状态良好,呈不规则多角形,随时间推移,细胞数目渐增多。大蒜素组和奥沙利铂组细胞,随药物作用时间的延长,细胞数目逐渐减少,体积缩小,形状变圆,部分胞浆内出现空泡,可见有悬浮细胞。联合用药组,上述变化更明显,悬浮细胞明显增多。4大蒜素和奥沙利铂对细胞周期的影响。大蒜素诱导HCT-8细胞24h后,细胞周期发生了明显变化。和对照组比较,大蒜素组和联合用药组的G₀/G₁期细胞减少,G₂/M期细胞增加（均为P＜0.01）,而S期细胞无明显变化（均为P＞0.05）;奥沙利铂组各周期与对照组比较无明显变化（均为P＞0.05）。5.大蒜素和奥沙利铂对细胞凋亡的影响。药物作用24h后,与对照组比较,大蒜素组、奥沙利铂组及联合用药组的凋亡率均增加（P＜0.01）;与奥沙利铂组、大蒜素组分别比较,联合用药组细胞凋亡率明显增高（均为P＜0.01）。6.caspase-3的阳性表达率。处理因素作用24h后,与对照组比较,大蒜素和奥沙利铂各单药组及联合用药组caspase-3阳性表达率均增加（P＜0.01）;与各单药组比较,联合用药组caspase-3阳性表达率均增加（P＜0.01）。结论:1.大蒜素对大肠癌细胞系HCT-8细胞具有增殖抑制作用。2.大蒜素和奥沙利铂联合应用对HCT-8细胞的增殖抑制作用明显增强,两药合用表现为协同作用。3.大蒜素能促进HCT-8细胞的凋亡。大蒜素和奥沙利铂联合作用细胞后,凋亡率明显升高。4大蒜素可将HCT-8细胞阻滞于G₂/M期。5.大蒜素可以与奥沙利铂联合应用,可以减少奥沙利铂应用剂量。

全文目录

中文摘要  3-6
Abstract  6-11
论文部分大蒜素联合奥沙利铂对HCT-8细胞生长的影响及机制探讨  11-35
  前言  11-12
  材料和方法  12-18
  结果  18-22
  讨论  22-27
  结论  27-28
  附图  28-32
  参考文献  32-35
综述部分大蒜素抗肿瘤作用  35-45
  正文  35-42
  参考文献  42-45
英文缩略词索引  45-46
攻读学位期间发表文章  46-47
致谢  47

大蒜素联合奥沙利铂对HCT-8细胞生长的影响及机制探讨

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