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孝顺竹木质素合成关键酶基因的克隆与表达分析

作　者: 卞林玲
导　师: 项艳
学　校: 安徽农业大学
专　业: 园林植物与观赏园艺
关键词: 孝顺竹 木质素 4CL COMT CCoAOMT CAD 原核表达
分类号: S795
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


孝顺竹(Bambusa multiplex (Lour.)Raeuschel)属于禾本科(Gramineae)竹亚科(Bambusoideae)箣竹属(Bambusa)植物。我国是世界上竹类资源最丰富的国家之一,孝顺竹在我国的栽培面积十分广泛,有着很高的经济价值。孝顺竹植物因其具有速生、纤维素含量高等特点,成为优良的造纸原料。然而,在竹材制浆造纸工业中,由于竹材中富含木质素,在造纸工业中必须去除木质素。大量的化学药品的投入,不仅大大增加了造纸的成本,也造成了严重的环境污染。因此,利用生物工程手段,在不影响竹材生长的前提下,改变木质素含量或者改变其制浆性能,培育出出适合板材加工的竹材新品种,已经成为当前竹类植物遗传育种工作的一项重要课题。在木质素代谢苯丙烷代谢途径中,4CL是木质素生物合成途径的核心酶之一。COMT、CCoAOMT和CAD是两种位于木质素特异合成途径下游的酶类,对于木质素合成调控也具有重要作用。本论文采用RT-PCR结合RACE方法,从一年生孝顺竹笋中克隆了木质素合成过程中非常重要的四个相关酶基因4CL、COMT、CCoAOMT和CAD。运用生物信息学方法对其核苷酸序列、编码的氨基酸序列进行分析。并利用半定量PCR技术对孝顺竹一年生笋、叶、竿箨、茎植物材料,分析了CAD基因在不同表达部位中表达丰度的变化。获得了如下主要结果:(1)采用Trizol法和试剂盒法提取孝顺竹的笋、叶、幼茎和竿箨的总RNA。经过验证,提取的RNA质量好,纯度高,可以用作分子生物学研究。(2)采用RT-PCR和RACE法相结合,获得了孝顺竹CAD基因全长cDNA,全长共1134bp。GenBank登录号为GU985522。该序列的5′端存在41bp的非翻译区(UTR),中间为1107bp的开放阅读框(ORF),3′端非翻译区(UTR)长度为163 bp和polyA尾巴18 bp,该基因编码368个氨基酸的蛋白,分子量为39.0 kD,等电点为6.06。(3)利用Pfam程序分析CAD基因,结果显示,CAD具有两个保守结构域:醇脱氢酶GroES-like结构域(Alcohol dehydrogenase GroES-like domain)和锌结合脱氢酶(Zinc-binding dehydrogenase)结构域,分别对应34-149和191-315氨基酸残基,这与目前所报道的肉桂醇脱氢酶基因有这两个结构域像符合。比对分析结果表明,与禾本科植物水稻,玉米等有很高的相似性,与水稻相似性高达高达97.0%。系统进化树分析表明,孝顺竹CAD基因与水稻CAD基因同源性较高。(4)采用RT-PCR方法对CAD基因进行组织特异性表达分析,结果显示,CAD基因在孝顺竹笋中表达量最高,在幼茎、叶和竿箨中亦有低水平表达。(5)获得了长度分别为278 bp、429bp和257bp的4CL、COMT和CCoAOMT基因片段,GenBank登录号分别为FJ787494、FJ790329和HM245382。分别编码92、142、85个氨基酸。4CL基因片段和水稻、玉米、慈竹的4CL基因相似性达95%以上;CCoAOMT片段与毛竹、水稻、玉米的CCoAOMT基因具有95%以上的相似性;COMT片段与玉米、绿竹、甘蔗基因相似性达90%以上。(6)构建了孝顺竹CAD基因的原核表达载体pE-SUMO-CAD,利用IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表明,该基因表达的蛋白分子量约39kD左右,其表达产物主要以包涵体的形式存在与沉淀中。(7)构建了孝顺竹CAD基因的植物过量表达载体pCAMBIA1301-CAD,为进一步遗传转化奠定基础。综上所述,本文成功地从孝顺竹中克隆出4CL、CCoAOMT、COMT和CAD基因。利用多种生物信息学软件,对四个基因进行基因序列和氨基酸序列分析,并分别构建进化树。成功构建了CAD基因原核表达载体pE-SUMO-CAD,优化了该木质素酶诱导表达的参数。成功构建了CAD基因的植物表达载体,为进一步进行孝顺竹木质素基因工程研究奠定基础。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-11
1 文献综述  11-23
  1.1 木质素概述  11-13
  1.2 木质素合成关键酶基因国内外研究现状  13-17
    1.2.1 苯丙酸途径上的调控涉及的酶类  14-15
    1.2.2 木质素单体特异合成相关的酶类的研究  15-16
    1.2.3 木质素特异合成途径下游酶类的调控研究  16-17
  1.3 竹木质素研究进展  17-18
  1.4 木质素单体合成相关酶的主要类型  18-19
    1.4.1 氧化还原酶类  18-19
    1.4.2 转移酶类  19
    1.4.3 裂合酶类  19
    1.4.4 合成酶类  19
  1.5 cDNA 的3’和5’的RACE 反应概述  19-23
2 引言  23-27
  2.1 研究背景  23-24
  2.2 研究目的和意义  24
  2.3 研究内容、目标  24-26
    2.3.1 研究内容  24
    2.3.2 研究目标  24-26
  2.4 本研究采用的技术路线  26-27
3 材料和方法  27-44
  3.1 实验材料  27
    3.1.1 植物材料  27
    3.1.2 实验载体与菌株  27
  3.2 实验主要试剂  27
  3.3 实验主要仪器设备  27
  3.4 实验引物设计  27-28
  3.5 孝顺竹 CAD 基因的克隆  28-36
    3.5.1 孝顺竹总RNA 的提取  28-29
    3.5.2 孝顺竹总RNA 的检测  29
    3.5.3 孝顺竹cDNA 的合成  29-30
    3.5.4 PCR 反应及琼脂糖电泳  30-31
    3.5.5 PCR 扩增目的片段及产物回收  31
    3.5.6 目的片段与 T-载体的连接  31-32
    3.5.7 大肠杆菌感受态细胞制备  32
    3.5.8 重组子转化感受态细胞  32
    3.5.9 碱裂解法提取质粒  32-33
    3.5.10 质粒的酶切鉴定  33
    3.5.11 重组质粒的测序分析  33
    3.5.12 RACE(rapid amplification of cDNA ends)法末端片段扩增  33-35
    3.5.13 CAD 基因全长的拼接及生物信息学分析  35-36
    3.5.14 组织特异性表达分析  36
  3.6 CAD 基因过量表达载体构建  36-38
    3.6.1 CAD 基因过量表达载体的构建策略  36-37
    3.6.2 重组子的筛选及 PCR 验证  37-38
    3.6.3 过量表达载体转化农杆菌  38
    3.6.4 根癌农杆菌感受态细胞制备  38
    3.6.5 过量表达载体转化农杆菌  38
  3.7 原核表达载体pE-SUMO-CAD 的构建  38-42
    3.7.1 原核表达载体pE-SUMO-CAD 构建方法  38-40
    3.7.2 重组子的筛选及酶切验证  40-41
    3.7.3.外源基因的诱导表达  41
      3.7.3.1 外源基因的诱导表达  41
      3.7.3.2 外源基因表达条件的优化  41
    3.7.4 外源基因所编码蛋白质的SDS-PAGE 分析  41-42
      3.7.4.1 SDS 聚丙烯酰胺凝胶的灌制  41-42
      3.7.4.2 染色和脱色  42
  3.8 孝顺竹4CL、COMT、 CCoAOMT 基因片段的克隆  42-44
    3.8.1 引物设计及PCR 扩增  42-43
    3.8.2 重组、克隆和DNA 序列分析  43-44
4 结果与分析  44-59
  4.1 实验PCR 引物  44
  4.2 孝顺竹材料RNA 提取  44-45
  4.3 CAD 基因片段的克隆  45
  4.4 5’-RACE 和3’-RACE 扩增与分析  45-46
  4.5 CAD 基因全长的拼接及生物信息学分析  46-47
    4.5.1 基因cDNA 编码区全长的拼接与分析  46-47
    4.5.2 氨基酸序列比较与系统进化树分析  47
  4.6 基因在植物不同组织中的表达量分析  47-50
  4.7 过量表达载体的构建  50
  4.8 外源基因表达蛋白的SDS-PAGE 分析  50-54
    4.8.1 外源基因表达蛋白的SDS-PAGE 分析  50-51
    4.8.2 诱导表达条件的优化  51-54
      4.8.2.1 IPTG 的浓度  51-52
      4.8.2.2 低温诱导(25℃)  52-53
      4.8.3.3 培养基的不同pH 值对诱导表达产物的影响  53-54
  4.9 4 CL、COMT、 CCoAOMT 基因片段的获得与分析  54-59
    4.9.1 扩增目的片段的引物  54
    4.9.2 目的基因片段的获得  54-55
    4.9.3 氨基酸序列分析  55-59
5 讨论与结论  59-62
  5.1 讨论  59-60
  5.2 结论  60-62
参考文献  62-68
附录  68-75
  附录A 中英文缩写与注释  68-69
  附录B CAD基因GenBank提交序列  69-71
  附录C 4CL、COMT、CCoAOMT和CAD在NCBI中的BLAST截图  71-73
  附录D 4CL、COMT、CCoAOMT和CAD的cDNA序列  73-75
致谢  75-76
作者简介  76
在读期间发表的学术论文  76

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中图分类: > 农业科学 > 林业 > 森林树种 > 竹
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