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牛羊肉骨粉夹心ELISA检测方法的建立

作　者: 刘青涛
导　师: 王志亮；刘秀梵
学　校: 扬州大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 牛海绵状脑病快肌型肌钙蛋白I 慢肌型肌钙蛋白I 原核表达夹心ELISA方法单克隆抗体
分类号: S816.17
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

牛海绵状脑病(Bovine Spongiform Encephalopathy ,BSE)被国际兽疫局(OIE)列为B类动物传染病,在我国被列为一类动物疫病。它给全世界特别是发达国家的养牛业带来了巨大灾难,而且在食用了被BSE病原污染了的牛肉产品后,会引起人的新变异克雅氏症,严重威胁着人类健康,因此世界各国都在采取各种积极措施防止疯牛病的传播。英国的流行病学研究证实,污染的饲料是BSE传播的主要途径。因此为防止BSE的传播,国际动物卫生法典中明确规定,禁止在反刍动物的饲料中添加反刍动物肉骨粉。为保证这一措施的有效实施,必须加强对饲料中肉骨粉的检测。本研究在克隆表达牛肌钙蛋白I的基础上,研制了针对肌钙蛋白I的牛羊特异性的单抗,并进一步建立了肉骨粉检测的夹心ELISA方法。骨骼肌中的肌钙蛋白I(sTnI)是一种耐热性蛋白,并且在骨骼肌中的含量比较大(5mg/g),盐溶性,在储存和运输过程中不易丢失,因此sTnI是检测饲料中肉骨粉的一种比较理想的标志物。sTnI有快肌型和慢肌型两个亚型,牛的这两个亚型的核苷酸序列目前在GenBank中还没有被收录,但已被收录的哺乳动物的核苷酸序列的比对结果表明,这两个亚型的核苷酸序列在哺乳动物之间均具有很高的同源性(90%左右),因此我们根据GenBank中其他哺乳动物的核苷酸序列分别设计引物克隆了牛的快肌型肌钙蛋白I和慢肌型肌钙蛋白I。序列比对结果表明,我们克隆的这两个片段的核苷酸序列与GenBank中的其他哺乳动物的核苷酸序列均具有90%左右的同源性,这说明了我们克隆的这两个片段是牛的快肌型肌钙蛋白I和慢肌型肌钙蛋白I;随后将这两个片段插入到原核表达载体pET-28a(+)中,以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌对其进行了表达。免疫印迹试验表明,这两个原核表达产物的小鼠血清,均可以识别从牛骨骼肌中提取的肌钙蛋白I,这证明了我们的两个原核表达产物确实是牛的快肌型肌钙蛋白I和慢肌型肌钙蛋白I,也进一步证明了我们克隆的这两个片段确实是牛的快肌型肌钙蛋白I和慢肌型肌钙蛋白I的基因片段。

全文目录

中文摘要  2-4
英文摘要  4-7
符号说明  7-8
前言  8-13
  1 饲料显微镜学方法  8-10
  2 近红外光谱测定  10
  3 DNA方法  10-11
  4 免疫学方法  11-12
  5 小结  12-13
第一部分牛肌钙蛋白 I 的克隆以及在大肠杆菌中的表达  13-26
  1 材料  13
  2 方法  13-17
  3 结果  17-22
  4 讨论  22-26
第二部分牛快肌型肌钙蛋白 I 单克隆抗体的研制  26-32
  1 材料  26
  2 方法  26-28
  3 结果  28-31
  4 讨论  31-32
第三部分牛羊肉骨粉夹心ELISA检测方法的建立  32-47
  1 材料  32
  2 方法  32-35
  3 结果  35-37
  4 讨论  37-47
结论  47-48
参考文献  48-51
附录  51-53
致谢  53

牛羊肉骨粉夹心ELISA检测方法的建立

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