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飞机草细胞色素P450 CYP75基因cDNA全长的克隆与鉴定

作　者: 潘华清
导　师: 何龙飞
学　校: 广西大学
专　业: 作物栽培学与耕作学
关键词: 飞机草 细胞色素P450 CYP75 基因克隆 功能预测
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


用异硫氰酸胍法、CTAB法和Trizol法等三种方法提取飞机草总RNA均取得较好效果,但异硫氰酸胍法最适合本实验使用。根据菊科植物紫茎泽兰P450CYP75基因(AY954290)和拟南芥CYP75家族成员的核酸序列同源区设计引物,用RT-PCR方法首次从飞机草、泽兰、佩兰中获得大小分别为467bp、467bp、470bp的cDNA序列,分别命名为:FJC.CYP.M;ZL.CYP.M;PL.CYP.M。同源性分析表明,3个序列同源性达99%,同时与AY954290具有90%的同源性,说明它们都来自细胞色素CYP75家族。根据FJC.CYP.M核酸序列设计特异性引物,通过RACE-PCR方法克隆飞机草P450基因全长。3’RACE-PCR得到309bp cDNA序列,PolyA尾巴出现,命名为FJC.CYP.3。5’RACE-PCR得到702bp cDNA序列,命名为FJC.CYP.5。经比对发现,它与紫茎泽兰CYP75基因全长还差364bp,因此继续从紫茎泽兰CYP75基因前端设计上游引物,从FJC.CYP.5核酸序列设计下游引物,进行PCR,克隆得到一条长为384bp的cDNA序列,命名为FJC.CYP.5e。把所有飞机草细胞色素p450片段测序结果进行拼接,得到长为1653bp的cDNA序列,命名为FJC.CYP.COM,推导编码509个氨基酸,开放阅读框为31bp-1560bp,出现了3个经典的细胞色素P450氨基酸保守区域,其中一个为F××G×R×C×G,起始密码子ATG前27bp处出现了启动子序列TATAbox。功能预测表明飞机草P450蛋白为一个亲水性稳定蛋白,有内外膜共9个跨膜螺旋,定位于线粒体中。根据泽兰、佩兰中间片段设计引物,进行3’RACE-PCR,分别得到两条长为340bp、625bp的cDNA片段,分别命名为ZL.CYP.3、PL.CYP.3。经比对,初步推测ZL.CYP.3片段基因属于P450家族里某个叶绿体束缚蛋白基因,其具体的功能还有待进一步研究;PL.CYP.3片段属于P450家族的赤霉素控制蛋白基因,初步估计它参与植物激素赤霉素的合成。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-10
1 前言  10-19
  1.1 外来入侵植物  10-11
    1.1.1 外来入侵植物概况  10
    1.1.2 外来植物入侵途径及其成灾机制  10-11
    1.1.3 外来入侵植物的危害及防治  11
  1.2 飞机草  11-15
    1.2.1 飞机草的生物特性  11-12
    1.2.2 飞机草的分布  12
    1.2.3 飞机草的危害及防治  12-13
    1.2.4 飞机草的利用  13
    1.2.5 飞机草的化感作用  13-14
    1.2.6 飞机草的生理和分子生物学研究  14-15
  1.3 细胞色素P450  15-18
    1.3.1 细胞色素P450的分布和功能  15-16
    1.3.2 植物细胞色素P450基因的克隆、鉴定与表达  16-18
  1.4 本研究课题的目的  18-19
2 材料与方法  19-36
  2.1 试验材料  19
  2.2 主要实验仪器  19
  2.3 培养基及各种溶液的种类、组成与配制  19-20
    2.3.1 细菌培养基  19
    2.3.2 常用溶液及缓冲液  19-20
    2.3.3 抗生素  20
  2.4 实验方法  20-36
    2.4.1 引物设计  20-21
    2.4.2 RNA提取  21-23
    2.4.3 RNA反转录  23-26
    2.4.4 PCR  26-29
    2.4.5 PCR扩增产物检测  29
    2.4.6 PCR产物回收纯化和胶回收  29-31
    2.4.7 感受态制备  31-32
    2.4.8 连接  32-33
    2.4.9 转化  33
    2.4.10 小量质粒提取  33-35
    2.4.11 酶切验证  35-36
3 结果与分析  36-69
  3.1 RNA提取分析  36-39
    3.1.1 异硫氰酸胍法提取飞机草总RNA  36
    3.1.2 CTAB法提取不同植物RNA的比较  36-37
    3.1.3 Trizol法、异硫氰酸胍法提取飞机草RNA比较  37-38
    3.1.4 三种提取方法所获得的RNA质量分析  38-39
  3.2 飞机草细胞色素P450 CYP75基因cDNA全长的克隆与鉴定  39-61
    3.2.1 飞机草细胞色素P450 CYP75基因cDNA中间片段的克隆与鉴定  39-42
    3.2.2 飞机草细胞色素P450 CYP75基因cDNA3'RACE  42-47
    3.2.3 飞机草细胞色素P450 CYP75基因cDNA5'RACE  47-51
    3.2.4 飞机草细胞色素P450 CYP75基因cDNA剩余5'端部分的克隆  51-53
    3.2.5 飞机草细胞色素P450 CYP75基因cDNA全长的拼接及功能分析  53-61
  3.3 泽兰细胞色素P450 CYP75基因cDNA片段的克隆与鉴定  61-65
    3.3.1 泽兰细胞色素P450 CYP75基因cDNA中间片段克隆与鉴定  61-62
    3.3.2 泽兰细胞色素P450 CYP75基因cDNA3'RACE  62-65
  3.4 佩兰细胞色素P450 CYP75基因cDNA片段的克隆  65-69
    3.4.1 佩兰细胞色素P450 CYP75基因cDNA中间片段的克隆与鉴定  65-66
    3.4.2 佩兰细胞色素P450 CYP75基因cDNA3'RACE  66-69
4 讨论  69-72
  4.1 飞机草总RNA提取方法  69
  4.2 PCR优化  69-70
  4.3 飞机草、佩兰、泽兰细胞色素P450 CYP75基因cDNA中间片段的同源性  70
  4.4 飞机草细胞色素P450 CYP75基因cDNA全长的克隆  70-71
  4.5 佩兰、泽兰细胞色素P450 CYP75基因cDNA片段的克隆  71-72
5 研究结论  72-74
  5.1 飞机草总RNA的提取  72
  5.2 飞机草、泽兰、佩兰细胞色素P450 CYP75基因cDNA中间片段的克隆  72
  5.3 泽兰、佩兰细胞色素P450 CYP75基因cDNA3'RACE  72
  5.4 飞机草细胞色素P450 CYP75基因cDNA全长的克隆  72-74
致谢  74-76
参考文献  76-81
附录  81-90

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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