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溶栓酶产生菌的分离筛选鉴定及发酵、提纯研究

作　者: 张旭
导　师: 运珞珈
学　校: 华中科技大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生
关键词: 豆豉溶栓酶解淀粉芽孢杆菌菌种鉴定液体发酵优化分离纯化
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的:豆豉溶栓酶是由从豆豉中分离出的细菌所分泌的一种胞外酶,和日本的纳豆激酶具有相似的特性。与临床上常用的纤溶药物相比,具有许多优点:效价高、半衰期长、无抗原性、安全无毒、成本低廉等,有望开发成新一代溶栓药物,本课题拟对全国不同地方收集的豆豉样品进行分离筛选,得到可以产生纤溶酶的菌株,并对该菌株及其产生的酶进行一些基础研究,包括菌种鉴定、液体发酵探讨以及酶的分离纯化。方法:1.酪蛋白平板初筛,纤维蛋白平板复筛,得到产溶栓酶的细菌。2.对该菌株进行生理生化及16SrRNA鉴定,确定种属。3.采用单因素和正交实验相结合的方法,探讨液体发酵的最佳培养基和发酵条件。4.经过硫酸铵分段盐析,透析脱盐,G-50柱层析,分离得到酶的纯品并冷冻干燥保存。5.纤维蛋白平板法测定酶活,考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量,计算整个提纯过程中酶活的回收率和比酶活。6.SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝R-250染色,确定酶的分子量。结果:1.筛选到8株具有溶栓活性的菌株,以活性最高的一株菌XY-1作为研究对象。2.经生理生化和16S rRNA鉴定后,确定该菌为芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。3.培养基的最佳组成为:酵母提取物1%、乳糖3%、K2HPO4 0.1%、KH₂PO₄ 0.6%、MgSO₄ 0.1%、NaCl 0.05%、pH 9.0。最佳发酵条件为:温度35℃、装液量50ml/250ml、接种量500μl/50ml、发酵时间24h。4.经过整个提纯周期,豆豉溶栓酶的酶活回收率达到37%,蛋白质回收率19.8%,比酶活为1388.27 U/mg,纯化倍数为1.87倍。5.真空冷冻干燥得到粉末状酶制品,上SDS-PAGE电泳显示两条带,分子量约为12k和20k。结论:我国传统食品豆豉中同样可以分离到产溶栓酶的细菌,经生理生化和16SrRNA鉴定后确定为解淀粉芽孢杆菌。采用单因素和正交实验结合的方法优化液体发酵,效果较好,使产酶量由235.2U/ml提高到2089.3U/ml。经过整个分离提纯过程,酶活回收率虽较高,但纯化倍数不高,样品中含有两种蛋白质,对分离纯化方法有待于进一步研究。

全文目录

中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
前言  9-13
第一章豆豉溶栓酶产生菌的分离筛选和鉴定  13-34
第二章豆豉溶栓酶液体发酵的优化  34-46
第三章豆豉溶栓酶的分离纯化研究  46-59
参考文献  59-63
综述纳豆激酶的研究进展  63-76
  参考文献  72-76
致谢  76

溶栓酶产生菌的分离筛选鉴定及发酵、提纯研究

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