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小麦抗病基因同源序列分析及条锈菌诱导的防御酶活性研究

作　者: 张彬
导　师: 张怀渝
学　校: 四川农业大学
专　业: 生物物理学
关键词: 小麦条锈病抗病基因同源序列克隆防御酶系
分类号: S435.121
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 153次
引　用: 2次
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内容摘要

小麦条锈病是世界性的重要病害，严重威胁小麦生产。在我国，特别是西南麦区由于适宜的发病条件和现代农业造成的栽培品种和遗传背景的单一化，使得条锈病成为我国小麦生产上最为严重的病害，造成巨大的经济损失。本研究以小麦新品种川农17（R57）、川农19（R88）、及其它抗病品种（系）为材料，以条锈菌水源14、条中32和流行生理小种混合菌为诱导菌种，采用生化分析方法，RGA分析技术，借助生物信息学分析手段，研究病原菌诱导后抗病相关防御酶系活性的变化规律；并对小麦抗病相关的基因片段进行分离、克隆，探讨这些特异性片段结构与功能的关系；同时对四川省普遍使用的小麦抗病遗传材料的抗病基因同源序列多样性进行分析，为进一步阐明小麦抗病生化和分子机制，抗条锈病基因的分离、克隆，合理选择小麦抗性亲本提供理论依据。主要研究结果如下： 1 病原菌诱导后抗、感小麦品种可溶性蛋白及防御酶系活性变化分析表明： 1) 条锈菌水源14、条中32分别接种后，抗、感品种的可溶性蛋白含量在48h后出现高峰，而混合菌种接种后可溶性蛋白含量高峰均推后到72小时。2) 抗病品种的SOD活性在接种（单、混合菌种）后在0-24h内均出现上升趋势，感病品种的SOD活性在该时间段均出现不同程度的降低趋势。3) 抗病品种的POD活性在接种（单、混合菌种）后0-96h内总体上呈上升趋势，其最终活性均高于感病品种，而感病品种的POD变化呈现两个峰值：混合菌系接种后POD活性的变化较单菌接种显著。4) 抗病品种的CAT活性在接种后0-24h迅速降低，此后略有回升，R88 CAT活性总体上高于R57；感病品种在整个过程中CAT活性变化不明显：接种单菌系与混合菌系CAT活性变化无明显差异。 2 利用RT-PCR技术对小麦抗性材料进行扩增，共有78对RGA引物组合扩增出清晰可辨谱带，通过1.5％的琼脂糖电泳共检测出142条较强的条带，平均每对引物扩增出1.82条。其中，引物Xal-NBS-F／Xal-NBS-R在R88品种（接种诱导48h）中扩增出一条特异性条带RGA₇₀₂；引物XalLR-F／XalLR-R在10N材料中（接种诱导24h和72h）均扩增出另一条特异性条带RGA₂₀₀。序列分析表明：1) RGA₇₀₂编码的氨基酸序列与玉米、黑麦草及水稻的蛋白磷酸酯酶2A相似达95％以上，该序列编码的产物可能参与植物抗病代谢过程。2) RGA₂₀₀编码的氨基酸序列与大麦、水稻、玉米的酰基转移蛋白具有较高的相似性（＞76％），但该序列含多个终止密码子，推测其可能是一个假基因。

全文目录

中文摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
缩略词  10-16
第一章文献综述  16-34
  1.小麦条锈病的危害性及研究  16-17
  2.小麦抗病相关生化特性的研究  17-20
    2.1 H_2O_2与植物抗感病的关系  17-18
    2.2 可溶性蛋白及防御酶系在植物抗病性中的作用  18-20
      2.2.1 可溶性蛋白与植物的抗、感病关系  18
      2.2.2 三种防御酶与植物的抗、感病关系  18-20
  3.抗条锈病基因的来源、定位及分子标记技术  20-27
    3.1 抗条锈病基因的来源、性质和定位  20-24
    3.2 分子标记  24-27
  4.植物抗病基因研究进展  27-32
    4.1 植物抗病基因的克隆  27
    4.2 R基因的结构  27-30
      4.2.1 核苷酸结合位点(NBS)  28
      4.2.2 亮氨酸富集重复区域(LRR)  28-29
      4.2.3 亮氨酸拉链(LZ)  29
      4.2.4 STK  29
      4.2.5 TIR和CC  29-30
      4.2.6 编码毒素还原酶(Toxin reductase)  30
    4.3 植物抗病基因同源序列在候选抗病基因克隆和标记中的应用  30-32
  研究目的和意义  32-33
  本研究的技术路线  33-34
第二章不同类型条锈菌诱导下小麦抗病品种可溶性蛋白与防御酶系活性的变化  34-41
  1 材料和方法  34-36
    1.1 实验材料  34
      1.1.1 小麦材料  34
      1.1.2 菌种  34
    1.2 实验方法  34-36
      1.2.1 接种与取样  35
      1.2.2 酶液的提取  35
      1.2.3 可溶性蛋白含量的测定  35
      1.2.4 过氧化物酶(POD)的活性  35
      1.2.5 超氧化物歧化酶(SOD)的活性  35
      1.2.6 过氧化氢酶(CAT)的活性  35-36
  2 实验结果  36-39
    2.1 可溶性蛋白含量的变化  36
    2.2 SOD活性的变化  36-37
    2.3 POD活性的变化  37
    2.4 CAT活性的变化  37-39
  3 讨论  39-41
第三章从小麦gDNA与cDNA中分离抗条锈病相关的RGAs  41-62
  1 材料和方法  41-47
    1.1 实验材料  41-42
      1.1.1 小麦材料  41-42
      1.1.2 黑麦材料  42
      1.1.3 含抗条锈基因近等基因系材料  42
      1.1.4 条锈菌种  42
    1.2 试剂及仪器  42
      1.2.1 主要试剂  42
      1.2.2 主要仪器设备  42
    1.3 实验方法  42-47
      1.3.1 接种处理  42-43
      1.3.2 条锈病抗性鉴定  43-44
      1.3.3 总DNA提取  44
      1.3.4 总RNA的提取  44
      1.3.5 逆转录反应  44-45
      1.3.6 RGA-PCR扩增  45
      1.3.7 PCR产物检测  45-46
      1.3.8 PCR产物的回收纯化和克隆  46-47
        1.3.8.1 PCR产物的切胶回收  46
        1.3.8.2 质粒DNA的转化  46-47
        1.3.8.3 阳性克隆的PCR鉴定与保存  47
    1.4 序列分析  47
    1.5 BLAST引物设计  47
  2 结果分析  47-57
    2.1 DNA和RNA的提取  47-48
      2.1.1 DNA的提取  47-48
      2.1.2 RNA的提取  48
    2.2 反转录PCR(RT-PCR)  48-49
      2.2.1 反转录  48-49
      2.2.2 RGA-PCR扩增  49
    2.3 特异性片段的克隆、测序及分析  49-52
      2.3.1 RGA_(702)和RGA_(200)的回收、克隆及测序  49-50
      2.3.2 RGA_(702)和RGA_(200)的序列分析  50-52
    2.4 RGA特殊引物设计与扩增  52-57
      2.4.1 抗条锈病基因及其编码蛋白的检索结果与分析  52-55
      2.4.2 RGA引物扩增结果  55
      2.4.3 特异性条带的克隆及序列分析  55-57
  3 讨论  57-62
    3.1 抗病基因同源序列(RGA)法为植物抗病基因的克隆提供捷径  57-58
    3.2 RT-(RGA)PCR的优点及不足  58-59
    3.3 生物信息学在RGA分析中的应用前景  59-61
    3.4 RGA法的不足及改进  61-62
第四章四川小麦抗病遗传材料的RGAs多样性分析  62-72
  1 材料与方法  62-65
    1.1 实验材料  62-63
    1.2 实验方法  63-65
      1.2.1 抗性鉴定  63
      1.2.2 DNA的提取  63
      1.2.3 引物合成和PCR扩增  63
      1.2.4 电泳、银染及照相  63-65
      1.2.5 聚类分析  65
  2 结果分析  65-68
    2.1 RGA-RCR  65
    2.2 抗性遗传多样性分析  65-68
  3 讨论  68-72
第五章结论  72-74
参考文献  74-79
附录攻读学位期间发表的论文  79-80
致谢  80

小麦抗病基因同源序列分析及条锈菌诱导的防御酶活性研究

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