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条锈菌诱导的小麦叶片SSH文库构建及其ESTs分析

作　者: 韩红娟
导　师: 陈佩度
学　校: 南京农业大学
专　业: 遗传学
关键词: 小麦 条锈病 SSH ESTs Yr26
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 5次
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内容摘要


小麦条锈病是由小麦条锈菌（Puccnia striiformis Westend f.sp.tritici Eriks）引起的一种广泛流行的世界性小麦病害,培育和推广抗病品种是防治小麦条锈病最经济有效且利于环境安全的措施。然而,由于小麦条锈菌具有高度的变异性,随着新致病小种的出现许多抗病品种相继“丧失”了抗性。普通小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系携带有位于1B染色体上的Yr26基因,能抵抗目前流行的多个条锈菌生理小种,因此对Yr26基因进行基因克隆研究对在育种中更好地利用该基因具有重要意义。本研究应用抑制性消减杂交（SSH）技术,以扬麦5号和92R137（6VS/6AL易位系）回交高代的抗病与感病植株为材料,建立条锈菌诱导的小麦叶片的SSH文库,获得3082个包含插入片段的克隆,对其中部分阳性克隆测序,获得70条非冗余ESTs序列。与GenBank中的序列进行BLAST分析,有18条ESTs与抗病基因具有较高同源性,9条ESTs与抗逆相关基因具有较高同源性,6条ESTs与转录调控过程中的基因具有较高的同源性,9条ESTs与细胞代谢及膜蛋白基因具有较高同源性,8条ESTs与电子转移基因及细胞构成蛋白基因具有较高的同源性,另外还有20条ESTs未找到与之同源性较高的基因。利用条锈菌诱导不同时间段的扬麦5号与92R137的cDNA进行RT-PCR半定量分析,有8条ESTs受条锈菌侵染后表达水平上升；有3条ESTs受条锈菌侵染后表达水平下降,有4条ESTs在条锈菌侵染后表现为组成型表达。与热激蛋白同源性较高的HSSH17受条锈菌诱导上调表达,在抗病亲本92R137中的表达水平明显高于在感病亲本扬麦5号中的表达水平。利用中国春缺体/四体及中国春缺失系将9条ESTs分别定位于第一,第二,第三,第五部分同源群染色体上。其中HSSH71同源基因位于5A,5D上；HSSH12同源基因被定位于染色体5BS-0.71-1.0区段；HSSH16同源基因被定位于染色体2AL-0.77-1.0区段及2BL-0.69-0.89区段；HSSH17同源基因被定位于染色体3BL-0.31-0.63区段；HSSH19同源基因被定位于染色体2BL-0.65-0.69区段及2DL-0.49-0.76区段；HSSH28同源基因被定位于染色体3AL-0.42-0.78区段；HSSH30同源基因被定位于染色体1BS-0.84-1.0区域；HSSH58同源基因可能位于着丝粒附近；HSSH61同源基因被定位于染色体3BL-0.63-1.0区段。利用本实验室王春梅所开发Yr26分子标记WE171, WE173, WE177, WE201, WE202, WE210所对应ESTs与二倍体短柄草基因组序列比对,发现短柄草Super8与小麦染色体1BL-6区段具有很高的共线性。在该区段利用预测的抗病基因在小麦和大麦中的同源序列设计引物开发标记,利用扬麦5号×92R137的F2群体进行检测,标记HJ-9与Yr26紧密连锁,位于标记WE173与WE210之间。

全文目录


摘要  7-9ABSTRACT  9-11第一部分 文献综述  11-37  一 小麦条锈病危害及抗条锈病基因遗传研究  11-14    1 小麦条锈病危害  11    2 小麦抗条锈病基因遗传研究  11-14      2.1 小麦抗条锈病基因的遗传研究方法  12-14        2.1.1 常规杂交法  12-13        2.1.2 基因推导法  13-14        2.1.3 非整倍体法  14  二 小麦抗条锈病基因克隆研究进展  14-18    1 禾谷类作物抗病基因克隆现状  15-16    2 小麦抗条锈病基因克隆研究进展  16-18  三 抑制性消减杂交技术及ESTs分析  18-28    1 抑制性消减杂交技术原理及应用  18-23      1.1 抑制性消减杂交技术原理  18-19      1.2 抑制消减杂交技术操作步骤  19-21      1.3 SSH技术的应用  21-23    2 ESTs分析  23-28      2.1 cDNA文库构建  24-25      2.2 ESTs随机测序  25      2.3 序列前处理  25      2.4 聚类和拼接  25-26      2.5 基因注释及功能分类  26-27      2.6 ESTs代谢途径及对应基因产物的系统分析  27-28      2.7 ESTs数据的后续分析  28        2.7.1 基因核苷酸序列分析  28        2.7.2 蛋白质序列分析  28  四 比较基因组学与小麦抗条锈病基因分子标记  28-37    1 植物比较基因组学研究策略与进展  28-32      1.1 比较基因组学的兴起  28-29      1.2 比较基因组学在植物中的应用  29-32        1.2.1 比较遗传作图  29-30        1.2.2 基因结构区域的微共线性研究  30-31        1.2.3 基于比较基因组学的QTL比较与基因克隆  31-32    2 小麦抗条锈病基因分子标记研究进展  32-37第二部分 研究报告  37-77  引言  37-38  一 材料与方法  38-49    1 材料  38    2 方法  38-49      2.1 培养和接种  38-39      2.2 取样  39      2.3 总RNA提取  39      2.4 总RNA中基因组DNA的去除  39-40      2.5 抑制消减杂交(SSH)文库构建  40-46        2.5.1 cDNA第一链合成  40-41        2.5.2 cDNA第二链合成  41        2.5.3 Rsa Ⅰ酶切及接头连接  41-42        2.5.4 两次消减杂交  42-43        2.5.5 两次PCR扩增  43-44        2.5.6 感受态细胞的制备及SSH-PCR产物的连接转化  44        2.5.7 菌液PCR及文库片段大小检测  44-45        2.5.8 地高辛差式筛选  45-46        2.5.9 阳性克隆的测序  46        2.5.10 序列分析  46      2.6 半定量PCR  46-47        2.6.1 第一链cDNA合成  46-47        2.6.2 第一链cDNA浓度定量  47      2.7 比较基因组学开发Yr26分子标记  47-49      2.8 分子标记的遗传作图  49  二 结果与分析  49-73    1 SSH文库构建及ESTs功能分析  49-68      1.1 总RNA的提取  49      1.2 SSH文库的构建  49-53        1.2.1 双链cDNA的合成  50        1.2.2 RsaⅠ酶切  50-51        1.2.3 两次PCR扩增  51        1.2.4 SSH-PCR产物的连接转化及文库片段大小检测  51-53        1.2.5 地高辛标记探针的SSH文库差式筛选  53      1.3 测序及ESTs生物信息学分析  53-57      1.4 ESTs表达分析及物理定位  57-68        1.4.1 条锈菌诱导ESTs表达分析  57-62        1.4.2 条锈菌诱导表达ESTs的物理定位  62-68    2 利用比较基因组学开发Yr26分子标记  68-72      2.1 与小麦染色体1BL-6区段共线性短柄草序列寻找  68-72    3 引物HJ-9的扩增及遗传图谱构建  72-73  三 讨论  73-77    1 SSH文库的构建与ESTs分析  73-75      1.1 SSH文库的构建  73-74      1.2 ESTs分析  74-75        1.2.1 定位于第一群ESTs的分析  74-75        1.2.2 在92R137与扬麦5号中差异表达ESTs的分析  75      1.3 SSH文库的缺点  75    2 利用比较基因组开发Yr26分子标记  75-77全文结论  77-79参考文献  79-91致谢  91

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 麦 > 小麦
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