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Toll样受体2胞外结构域的结构—功能关系

作　者: 张林
导　师: 于文彬；丁振若
学　校: 第四军医大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: Toll样受体克隆真核表达蛋白质结构预测蛋白质-蛋白质相互作用静电相互作用
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

天然免疫位于多细胞生物的第一线，负责在病原体入侵时迅速控制感染。同时，对于脊椎动物，参与这种早期的免疫反应的各种细胞和分子对后继的获得性免疫的形成具有决定性的作用。最初对果蝇以及后来对小鼠进行的遗传学研究发现，Toll蛋白家族在天然免疫中具有重要作用。目前认为，这些蛋白属于细胞因子受体(果蝇Toll)或模式识别受体(哺乳动物TLRs)，能够激活类似但不完全相同的信号转导途径。进化上古老的哺乳动物Toll样受体家族属于Ⅰ型跨膜蛋白家族，且其成员正不断增多。在哺乳动物TLR家族已知的10个成员中，已知TLRl、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7和TLR9与微生物成分识别有关。其中，TLR4识别的是LPS。TLR9为CpG DNA的受体。TLR5为细菌鞭毛蛋白的受体。TLRs的胞外结构域由富含亮氨酸重复序列(LRRs)组成，而胞浆段则为Toll／IL-1R(TIR)同源结构域。其中，LRRs主要负责参与蛋白质—蛋白质相互作用。LRR的每个重复结构单位都由大致相互反向平行的一个β-折叠和α-螺旋构成。微生物产物与TLRs结合后，有多个胞内信号转导途径被激活和启动。TLR介导的NF-kB的激活代表着天然免疫系统中的一个至关重要的部分。目前发现，TLR2能够参与识别多种微生物产物。TLR2是识别GPB的肽聚糖(PGN)和细菌脂蛋白(BLP)所必需的受体。此外，其配体还包括分枝杆菌细胞壁脂阿拉伯甘露聚糖、克氏锥虫(Trypanosoma Cruzi)糖基化磷脂酰脂质、表皮葡萄球菌酚可溶性modulin(phenol-soluble modulin)、酵母菌细胞壁以及问号状钩端螺旋体(Leptospira interrogans)和Porphyromonas gingivitis产生的非典型性LPS等。TLR2介导识别一些配体时，尚需要与TLRl或TLR6等辅助分子进行合作。随着TLR研究的逐步深入，天然免疫正重新受到免疫学及微生物学界的重视。过去几年的研究，明显拓宽了我们对天然免疫识别机制及其对获得性免疫的影响的认识与了解。对其信号转导途径的深入了解，必将带来针对各种感染第四军医大学硕士学位论文性疾病（如脓毒性休克、风湿性关节炎及哮喘等）的，更为有效的治疗策略与方法。总体上，本研究采用了分子生物学实验与生物信息学相结合的方法，旨在探索TLRZ胞外结构域的结构及其在病原微生物成分激活的TLRZ信号转导途径中的功能。一方面，首先构建TLRZ胞外结构域及其氨基端和梭基端片段真核表达载体。提取HL－60细胞总RNA，以RT－PCR方法获取了TLRZ胞外域。DNA片段，将其与pGEM1 Easy载体连接，转化E．colt JM109，建立了 TLRZ胞外域的CDNA克隆：籍此，又相继克隆了胞外域的氨基端和羟基端片段，并将这三个片段克隆到真核表达载体pCDNA3中。然后，使用这H个真核表达载体瞬时转染人源单核细胞系THP刁，继而用金黄色葡萄球菌肽聚糖（PGN）刺激，以核因子NF－kB活性作为指标观察比较三个重组体的生物学活性。NF．kB活性检测采用凝胶电泳迁移率变化分析法爬MSA＼另一方面，充分利用互联网中现有的数据库及软件等生物信息学资源，从初步的TLRZ胞外结构域结构预测出发，试图从一个新的角度综合分析该结构域的结构一功能关系，揭示该结构域作为信号感受装置在TLRZ所介导的信号转导中的具体作用。本课题所采用的蛋白质结构预测工具，包括3D－PSSM、SPDBV、Rsmol、WHAT IF、QSE和 GMMM等，全部来自于互联网。此外，还采用与上述类似的方法，对CD14及MD－2进行了相对简单的三维结构模建与分析；同时，还对TLRI－6的胞外结构域、CD14及MD－2等分子的等电点进行了比较，并对TLR16的胞外结构域的序列联配模型进行了分析比较。将RT－PCR所获得序列与GenBank中的人TLRZ全长cDNA序列进行比对分析表明，它们之间仅有4个碱基不同，同源性为0．998。PCR产物克隆所获得质粒分别命名为pGEM－TeX、pGEMNTeX和pGEM（TeX。在此基础上构建的真核表达载体分别命名为 pCDNA－TeX、pCDNA－NTeX和pCDNA－CTeX。 EMSA结果显不，转染pCDNA－TeX和pCDNA－NTeX的THPl细胞在PGN刺激下，其NF－kB活化水平明显低于pCDNA（TeX转染的、pCDNA3空质粒转染的对照组及野生型细胞。 QSE（Quatemeq StrUcture EXplor肛）根据其氨基酸序列进行的四级结构预测发现，该结构域、其氨基端部分及中部至氨基端部分都较可能形成同源二聚体。以3D－PSSM序列联配所获得的序列一结构比对结果为基础，使用SPDBV及WHA IF等工具，进行结构模建，获得了该结构域的三维结构粗略模型。该结构域的三维结构大致呈马蹄形，与核糖核酸酶抑制剂（l）等LRR蛋白非常类似。基于模型的一系列分析中，静电势的计算与可视化说明，TLRZ胞外结构域总体上以负电荷占据优势，且其中部附近存在一个负静电势分布更为密集的区域。对TLR16的胞外结构域、CD14及MD－2等分子等电点的比较分析，以 5二凡回刀刃LIn 吕心ucdw回一向回Cto刃用＠h山刊k眈肛dd卜匡凶b回n山h仍wDOt吕扣OJ瞩印卜刃忧＠?

Toll样受体2胞外结构域的结构—功能关系

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