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猪戊型肝炎病毒基因AG02的融合表达及间接ELISA诊断的初步建立

作　者: 张可心
导　师: 赵敏
学　校: 东北林业大学
专　业: 微生物
关键词: 戊型肝炎病毒 ORF2片段原核表达克隆间接ELISA
分类号: S854.43
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 67次
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内容摘要

采用RT-PCR技术扩增猪戊型肝炎病毒(SHEV)结构蛋白基因ORF2部分片段AG02。将该片段插入pET32a表达载体,命名为PET-HEV,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE-3),经1mM IPTG诱导得到表达,进行SDS-PAGE分析,证明该片段得到融合表达,分子量为33KD。Western blot分析表明,重组蛋白可以与HEV阳性血清反应,表明该蛋白具有良好的抗原性。以纯化的重组蛋白建立了初步的间接ELISA方法。以纯化的重组蛋白建立了初步的间接ELISA方法,经方阵滴定确定最佳包被浓度为2.43μg/mL,血清最佳的稀释比为1:40,与万泰试剂盒相比较,证明我们建立的ELISA方法有较高的特异性和敏感性。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
1 绪论  9-19
  1.1 戊型肝炎概述  9-12
    1.1.1 戊型肝炎的病原学  9-10
    1.1.2 戊型肝炎病毒的分子生物学  10-11
    1.1.3 戊型肝炎病毒基因分型研究  11-12
  1.2 戊型肝炎的流行病学  12-13
  1.3 临床症状和病理变化  13-14
  1.4 诊断  14-15
    1.4.1 酶联免疫吸附实验(ELISA)  14
    1.4.2 PCR方法  14
    1.4.3 血清中和实验  14-15
    1.4.4 免疫荧光试验(IFA)  15
    1.4.5 免疫印迹(IB)  15
    1.4.6 免疫电镜(IEM)  15
  1.5 戊型肝炎的研究进展  15-18
    1.5.1 HEV抗原表位的研究  16-17
    1.5.2 疫苗的研究  17
    1.5.3 目前存在的问题  17-18
  1.6 本实验研究的目的和意义  18-19
2 材料与方法  19-28
  2.1 材料  19-20
    2.1.1 抗体  19
    2.1.2 质粒与菌株  19
    2.1.3 培养基  19
    2.1.4 SDS-PAGE电泳  19
    2.1.5 主要试剂  19-20
    2.1.6 主要仪器设备  20
  2.2 方法  20-25
    2.2.1 HEV cDNA模板的获得  20-21
    2.2.2 HEV ORF2基因片段的克隆与扩增  21-22
    2.2.3 重组表达载体的构建  22-23
    2.2.4 阳性重组质粒的表达  23-24
    2.2.5 表达蛋白的纯化  24
    2.2.6 表达产物的鉴定  24-25
  2.3 间接ELISA程序的建立  25-27
    2.3.1 ELISA试剂配制  25-26
    2.3.2 方阵滴定实验确定抗原和血清的包被浓度  26
    2.3.3 酶标抗体工作浓度的确定  26
    2.3.4 重组蛋白抗原的包被条件的确定  26
    2.3.5 血清和酶标二抗反应时间的确定  26
    2.3.6 底物作用时间  26
    2.3.7 包被液的选择  26
    2.3.8 稀释液的选择  26-27
  2.4 阴阳性临界值的判断  27
  2.5 ELISA工作性质确定  27
    2.5.1 阻断试验  27
    2.5.2 敏感性试验  27
    2.5.3 重复性试验  27
    2.5.4 稳定性试验  27
  2.6 重组抗原的应用  27
  2.7 小结  27-28
3 结果与分析  28-37
  3.1 AG02基因的扩增结果  28
  3.2 AG02测序结果及分析  28-29
  3.3 重组表达质粒PET-HEV的鉴定  29
  3.4 融合蛋白的表达  29-30
  3.5 Western blot分析  30
  3.6 ELISA最佳工作条件的确定  30-34
    3.6.1 抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释度的确定  30-31
    3.6.2 酶标抗体工作浓度的确定  31
    3.6.3 重组蛋白抗原的包被条件的确定  31-32
    3.6.4 血清和酶标二抗反应时间的确定  32-33
    3.6.5 底物作用时间  33
    3.6.6 包被液的选择  33-34
    3.6.7 封闭液的选择  34
    3.6.8 稀释液的选择  34
    3.6.9 阴阳性临界值的确定  34
  3.7 ELISA工作性质分析  34-36
    3.7.1 阻断试验  34
    3.7.2 敏感性试验  34-35
    3.7.3 重复性试验  35
    3.7.4 稳定性试验  35-36
  3.8 重组抗原的应用  36
  3.9 小结  36-37
结论  37-38
参考文献  38-41
攻读学位期间发表的学术论文  41-42
致谢  42-43
独创性声明  43
学位论文版权使用授权书  43

猪戊型肝炎病毒基因AG02的融合表达及间接ELISA诊断的初步建立

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