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蛇毒cystatin在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

作　者: 张晓艳
导　师: 林建银；林旭；郑志竑
学　校: 福建医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: cystatin 基因克隆 Sf9 细胞杆状病毒表达系统
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

目的探讨蛇毒cystatin 在Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统中的表达。方法根据中华眼镜蛇蛇毒cystatin 蛋白的氨基酸序列合成cystatin 基因的四个片段,通过缓慢退火PCR 的方法将其拼接为完整的cystatin 基因,PCR 扩增蛇毒cystatin 基因,将其克隆到供体质粒pFastBacHTc 中,通过转化DH10Bac 菌筛选、鉴定并抽提获取高纯度的重组穿梭载体Bacmid-cystatin,经脂质体介导将重组穿梭载体转染Sf9 细胞,获取并扩增重组病毒,空斑分析确定病毒滴度,Western-blot分析适宜的重组融合蛋白表达时间和MOI 值,SDS-PAGE 分析细胞总蛋白,Western-blot 鉴定重组融合蛋白。结果1 构建了携带蛇毒cystatin基因片段的重组供体质粒pFastBacHTc -cystatin,经双酶切鉴定和序列分析证实蛇毒cystatin 基因已正确插入供体质粒的多克隆位点。2 构建了携带蛇毒cystatin 基因片段的重组穿梭载体Bacmid-cystatin,经PCR 鉴定分析证实蛇毒cystatin 基因已正确转座插入穿梭载体的转座接触位点。3 确定了重组融合蛋白在Sf9 细胞中表达的最佳时间是感染后96 h,适宜的MOI 值为10。该重组融合蛋白经SDS-PAGE、Western-blot 分析鉴定为蛇毒6×His-cystatin 融合蛋白,分子量为15000 道尔顿,与融合蛋白的理论分子量相

全文目录

英文缩略语  3-4
中文摘要  4-6
英文摘要  6-8
前言  8-11
材料与方法  11-25
  1 材料  11-12
  2 方法  12-25
结果  25-36
  1 pFastBacHTc-cystatin供体质粒的构建及鉴定  25-28
  2 Bacmid-cystatin重组穿梭载体的构建、鉴定和大量提取  28-29
  3 重组融合蛋白表达  29-36
讨论  36-42
  1 昆虫杆状病毒表达系统的优势和组成  36-38
  2 供体质粒和穿梭载体的构建与鉴定  38-39
  3 重组融合蛋白的表达与鉴定  39-42
小结  42-43
基本路线  43-44
参考文献  44-47
综述  47-56
致谢  56

蛇毒cystatin在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

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