学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示
重组人巨细胞病毒嵌合肽的表达纯化及活性研究
作 者: 余巍
导 师: 谢琪璇
学 校: 暨南大学
专 业: 发育生物学
关键词: 重组人巨细胞病毒嵌合肽 表达载体pPICAαA 毕赤酵母 高密度发酵 亲和层析 活性研究
分类号: R373
类 型: 硕士论文
年 份: 2005年
下 载: 75次
引 用: 0次
阅 读: 论文下载
内容摘要
人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染在人群中非常普遍,主要是呈隐性或亚临床感染,近年来发现该病毒不只在新生儿、免疫抑制及免疫缺陷患者中导致广泛的临床症状和死亡,而且可能与人类三大疾病--心血管疾病,恶性肿瘤及糖尿病有关,因而建立HCMV的快速检测方法具有重要意义。多种HCMV病毒蛋白可刺激机体产生相应的抗体,选用抗原性强、特异性好的蛋白抗原代替全病毒以检测HCMV感染,是提高HCMV感染诊断的敏感性和特异性的有效途径。国外的研究证实,HCMV的gp52蛋白和pp150蛋白具有较强的抗原性,在HCMV感染者的血清中其相应的抗体检出率较高,本实验室已成功构建串连有编码gp52 C末端和编码pp150 C末端两个基因片段的pPIC9K-rHCMVp表达质粒,并在毕赤酵母获得成功表达。但该质粒缺少纯化标记,不利于分离纯化,本研究将该质粒中人巨细胞病毒嵌合肽(rHCMVp)基因片段导入带纯化标志his6的pPICZαA中,重新构建、筛选了表达人巨细胞病毒嵌合肽(rHCMVp)的基因工程酵母。根据其基因序列,设计引物从pPIC9K-rHCMVp上扩增得到目的基因片段,并导入毕赤酵母诱导型表达载体pPICZαA中。通过电击将线性化的重组质粒转化到毕赤酵母GS115细胞中,筛选获得表达量较高的重组菌株,研究了该菌株生长的培养条件,包括不同诱导时间、甲醇浓度、pH值对人巨细胞病毒嵌合肽表达的影响。2L发酵罐进行了高密度发酵,经1%的甲醇、pH6.0的条件下诱导48h,最终菌体密度OD600达到180,每升发酵液中含目的蛋白78.7mg,比摇瓶提高了4.8倍的产量。rHCMVp嵌合肽蛋白可通过高密度发酵大量获得。通过金属螯合亲和层析分离纯化发酵液上清,获得较高纯度的rHCMVp嵌合肽蛋白,进行了活性研究。实验结果证实该蛋白能被抗全病毒血清检测,且具有免疫原性;与市售进口的ELISA人巨细胞病毒检测试剂盒相比,两种方法的一致性较好,我们选择的gp52和pp150两个片段的嵌合肽蛋白作为包被抗原可用于HCMV感染的检测,为制备或组装高特异性和敏感性的HCMV基因工程抗原试剂盒提供依据。
|
全文目录
第一部分 前言 7-13 1.1 人巨细胞病毒的研究现状 7-9 1.2 人巨细胞病毒感染的诊断方法 9-12 1.3 本研究的目的和意义 12-13 第二部分 材料与方法 13-28 2.1 实验仪器,材料和试剂 13-16 2.2 本研究的技术路线 16-17 2.3 实验方法 17-28 第三部分 实验结果 28-35 3.1 PCR法获得目的基因片段 28 3.2 重组质粒的构建和鉴定 28-29 3.3 重组质粒转化酵母和重组子的筛选 29 3.4 rHCMVp基因在酵母中的表达 29-30 3.5 rHCMVp高密度发酵条件的优化 30-31 3.6 工程菌株高密度发酵诱导培养 31-32 3.7 目的产物的纯化 32-34 3.8 目的蛋白活性实验 34-35 第四部分 讨论 35-44 4.1 表达载体的构建与鉴定 35-36 4.2 rHCMVp基因的电转化和酵母表达菌株的筛选 36-37 4.3 在巴斯德毕赤酵母中的表达条件的研究 37-38 4.4 巴斯德毕赤酵母高密度发酵 38-40 4.5 表达目的产物的纯化 40-41 4.6 目的蛋白生物活性研究 41-42 4.7 小结 42-44 第五部分 参考文献 44-50 附录一 各种试剂的配制方法 50-55 附录二 重组人巨细胞病毒(HCMV)嵌合肽的DNA测序结果 55-56 附录三 重组人巨细胞病毒(HCMV)嵌合肽的氨基酸序列 56-57 附录四 英文缩略词索引 57-58 附录五 在校期间发表研究论文情况 58-59 致谢 59
|
相似论文
- 杏鲍菇(Pleurotus eryngii)漆酶基因的体外诱变及在毕赤酵母中表达,TQ925
- Aspergillus niger Z-25葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母中的表达,Q78
- 香菇漆酶基因在毕赤酵母中的表达及对三苯甲烷类染料脱色的研究,TQ925
- 日本血吸虫重组蛋白rSjGST的表达纯化及单克隆抗体的制备和特性鉴定,R392
- 拮抗酵母菌抑菌机理及对草莓采后冷藏品质影响的研究,S668.4
- 根霉中β-葡萄糖苷酶基因克隆及表达,Q78
- 凝血因子Ⅷ在毕赤酵母中的表达,R554.1
- 转萝卜过氧化物酶基因RsPrx1酵母表达条件优化及其抗性机理研究,Q943.2
- 不同来源的谷胱甘肽合成酶对重组毕赤酵母合成谷胱甘肽的影响研究,TQ936.16
- 可溶性H-2D~b/IgG2b二聚体的构建与表达,R744.51
- 巴斯德毕赤酵母多糖的分离纯化及生物活性研究,Q936
- 用于溶藻弧菌快速检测的免疫磁珠技术的研究,S941
- 刺糖中多糖的提取分离工艺及性质研究,R284.1
- 蚯蚓纤溶酶的分离纯化及部分组分的性质,Q814.1
- 壳聚糖内切酶基因在毕赤酵母中的高效表达,Q78
- 黑曲霉α-葡萄糖苷酶的基因克隆、表达与定性,Q78
- 大鼠胰岛素原基因编码序列的克隆及表达,Q784
- 猪瘟病毒E~(rns)蛋白在毕赤酵母中的表达及其单克隆抗体制备,S852.65
- 构建日本血吸虫抗原Sj23的毕赤酵母和转基因紫花苜蓿表达系统,Q943.2
- OmpA信号肽介导的重组大肠杆菌生产α-环糊精葡萄糖基转移酶发酵优化,TQ925
- 黑曲霉β-葡萄糖苷酶的基因克隆与表达研究,TQ925
中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学(病原细菌学、病原微生物学) > 人体病毒学(致病病毒)
© 2012 www.xueweilunwen.com
|