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葡萄、桃抗病基因同源序列的克隆与分析

作　者: 王华峰
导　师: 房经贵；章镇
学　校: 南京农业大学
专　业: 果树学
关键词: 葡萄桃抗病基因同源序列克隆
分类号: S66
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

本文根据NBS-LRR类和STK类抗病基因的保守序列，采用基于同源序列的候选基因法，对不同抗病性的4个桃种类和5个葡萄种类进行了抗病基因同源序列的克隆与分析，其结果如下： 1．几种提取植物基因组DNA方法比较。提取桃基因组DNA的实验中，参照乔玉山等人的改良SDS微量法，并将微量法改为“中量法”，即用5ml离心管代替1.5ml离心管，加大了植物材料用量；并相应地增加DNA样品纯化次数；DNA溶解采用超纯无菌去离子水代替TE，最终获得了DNA浓度较大，质量较高的桃基因组DNA，为进一步所做的PCR反应实验，提供了良好的基础。用SDS法提取葡萄基因组DNA过程中，发现DNA样品有色素（糖类物质）存在。于是改采用CTAB法重新对葡萄基因组DNA进行了提取，并同样将微量法将改为“中量法”，最终既消除了色素的干扰，又获得了浓度较大，质量较高的葡萄基因组DNA。提取桃基因组DNA过程中采用的RNase的浓度为10mg／ml，完全消除DNA样品中的RNA杂质，而在提取葡萄基因组DNA过程中采用的RNase的浓度为0.1mg／ml，RNA杂质依然存在。 2．引物设计、PCR反应条件的优化和引物的筛选。根据NBS-LRR类中的拟南芥抗丁香假单孢杆菌基因RPS2和烟草抗花叶病毒基因N中保守的P-环（GGVGKTT）和跨膜结构域（GLPLAL）和STK类蛋白激酶的上游保守区（FG（K／V／I／S）VY（K／R）G）和下游保守区(D（V／I）YS（F／Y）G（V／I／M），总共设计了13对简并引物，其中NBS-LRR类引物组合9对，STK类引物组合4对。以葡萄和桃基因组DNA为模板，设置Mg²⁺梯度，从1.0mM到4.5mM，每0.5mM为一梯度，共8个Mg²⁺梯度，在此基础上，对常规PCR反应条件先后进行了优化：基因组DNA模板99-100℃彻底变性10分钟；热启动时间5分钟，温度95℃；退火温度设为低Tm值引物的Tm值5℃、Tm值低的引物用量提高到2.0ul。在优化的PCR反应体系下，13对所设计的简并引物中：NBS-LRR类引物组合WN3／WN5在Mg²⁺终浓度为3mM时，从5种葡萄材料中扩增出了清晰明显的特征条带；STK类引物组合WS2／WS4在4种桃材料中、Mg²⁺终浓度也为3mM时，有模糊的扩增条带出现。针对STK类引物，接着采用桃基因组DNA的PCR产物为模板进行再次PCR扩增，同时将退火温度提高。最后在退火温度为43℃时，减少了PCR的非特异性扩增获得了清晰的特征扩增产物。3.目的基因片段序列的分析. 回收PCR产物，连接转化，PcR检测后，进行测序，获得44个RGA序列，这些片段序列的大小在3 00一60Obp之间.初步异同分析后，得出”个各不相同的片段序列，其中18个来自葡萄，11个来自桃.在随后的氨基酸序列分析中，有21个片段能推导出完整的氛基酸序列.经.氛基酸序列比较发现，发现它们除两端的引物序列外，都基本具有杭病基因所特有的保守氛基酸结构域.即最终获得了21个抗病基因同源序列，其中从葡萄中获得15个NBs一LRR类杭病基因同源片段，从桃中6个STK类抗病塞因同源片段. 将这21个杭病塞因同源序列进行聚类分析得:从5种葡萄中共获得6类NBS一LRR类杭病基因同源序列;从4种桃中共获得4类STK类抗病基因同源序列.同时与已报道的相应同源序列也进行聚类分析知:来自99R的p一12与已克隆到的Ia了基因的氛基酸序列为一类，来自AKI的p一16与已克隆到的L瓦从万的基因的氛基酸序列为一类;来自皱叶黄露的t一3、t一16与已克隆的尸to、L厂10基因的氛基酸序列为一类，其t一5与已克隆的Ia21玉因的序列为一类. 然后将所获得的杭病基因同源序列之间、同时与已知抗病基因的氛巷酸序列进行了同源性比较分析，发现所获得的抗病基因同源序列总的来说与已知抗病基因的氛基酸序列同源性较低，多数没超过3。%，而它们之间的同源性则相对较高，多在40%一6眼之间.但也有个别的氛基酸序列与已知杭病基因的氛基酸序列同源性较高，从5种葡萄中共获得6类NBs一LRR类抗病基因同源序列中，如来自AKI的p一16与杭病基因L‘、从万的同源性分别为36.7%、32.7%、32.7%;来自”R的p一12与叁因Ial的孰基酸序列同源性为42.7%.从4种桃中共获得4类STK类抗病基因同源序列中，来自皱叶黄露的t一3、t一16与基因Pt口同源性为39.1%、42.2%;t一5与基因肋21、乙r10的氛基酸序列的同源性分别为 28.7%、32.。%.关键词:葡萄;桃;抗病基因;同源序列;克隆二-

全文目录

中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
缩略语  10-11
第一部分文献综述  11-24
  1 已克隆的抗病基因及其特点  11-15
  2 R基因作用机制  15-16
  3 应用以简并寡核苷酸为引物的PCR技术克隆基因家族成员  16-18
  4 R基因类似序列(RGA)的研究意义  18-22
  5 RGA在果树抗病基因研究上的应用  22-24
第二部分研究报告  24-73
  引言  24-25
  第一章植物基因组DNA的PCR分析  25-45
    1 材料与方法  25-27
      1．1 两种微量提取DNA方法的比较  25-26
      1．2 DNA含量的测定和完整性分析  26
      1．3 简并引物的设计  26
      1．4 PCR反应体系的优化  26-27
      1．5 目的基因片段的回收与测定  27
    2 结果与分析  27-38
      2．1 不同DNA提取方法的比较  27-30
      2．2 不同反应条件下的PCR扩增结果  30-35
      2．3 优化体系下的PCR重复扩增  35-37
      2．4 目的基因片段的回收后DNA的含量  37-38
    3 讨论  38-41
      3．1 植物基因组DNA的提取  38
      3．2 PCR扩增反应条件的优化和引物筛选  38-41
    附录1  41-45
  第二章获得的抗病同源序列的克隆与分析  45-73
    1 材料与方法  45-46
      1．1 感受态细胞的制备与保存  45
      1．2 连接反应  45
      1．3 转化  45
      1．4 α-互补检测  45
      1．5 阳性质粒的收获和阳性质粒DNA的提取  45-46
      1．6 阳性质粒DNA和菌液PCR鉴定  46
      1．7 测序及序列分析  46
    2 结果与分析  46-58
      2．1 克隆的α-互补检测  46-47
      2．2 质粒DNA的电泳检测  47
      2．3 质粒DNA和菌液的PCR比较鉴定  47-48
      2．4 测序结果与序列初步的异同分析  48-49
      2．5 抗病基因同源序列的氨基酸序列分析  49-56
      2．6 抗病基因同源序列的氨基酸序列聚类分析  56-57
      2．7 抗病基因同源序列的氨基酸序列同源分析  57-58
    3 讨论  58-61
      3．1 目的基因片段的克隆  58-59
      3．2 克隆的PCR鉴定分析  59
      3．3 克隆NBS-LRR类与STK类抗病基因同源序列的分析  59-61
    附录2-1  61-65
    附录2-2  65-73
全文讨论  73-76
参考文献  76-83
致谢  83

葡萄、桃抗病基因同源序列的克隆与分析

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