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一株产石杉碱甲蛇足石杉内生真菌的分离及其发酵条件的初步研究

作　者: 王吉祥
导　师: 朱笃
学　校: 江西师范大学
专　业: 生物化工
关键词: 竹黄菌Slf14 石杉碱甲 乙酰胆碱酯酶抑制剂 蛇足石杉 内生真菌
分类号: R284
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


蛇足石杉（Huperzia serrata （Thunb.） Trev.）是一种多年生小型珍稀药用蕨类植物,属石杉科石杉属（Huperzia）。石杉碱甲（Huperzine A,简称HupA）是首先从蛇足石杉中分离得到的一种生物碱,其对老年性痴呆、重症肌无力和记忆力减退等疾病有很好的疗效。迄今,HupA主要从蛇足石杉等石松植物中分离提取,但蛇足石杉等石松植物HupA含量低、生长缓慢,野生资源十分有限,且其人工栽培技术尚未突破,因此HupA生产存在严重的原料短缺问题,必需寻找可替代的生产方式,否则蛇足石杉等石松植物资源将面临生存的威胁。植物内生真菌能产生大量新的天然产物,有些内生真菌还可以产生与宿主植物相同或相近的代谢产物,已成为天然产物潜在的重要资源。据此,本文对产石杉碱甲蛇足石杉内生真菌进行了分离和筛选,并对产石杉碱甲内生真菌发酵条件进行初步研究,为利用内生真菌发酵生产石杉碱甲奠定基础。本研究从蛇足石杉根、茎、叶中共分离出内生真菌56株,其中乙酰胆碱酯酶抑制率达到70%以上的内生真菌有14株,占分离内生真菌总数的25%。菌株Slf14的抑制率最高,达到96.47%,因此对菌株Slf14菌种和产物鉴定及发酵条件进行了研究。通过形态学结合ITS和18SrDNA序列分析,菌株Slf14被归属为竹黄菌属（Shiraia）,命名为Shiraia sp. Slf14。薄层层析、高效液相色谱、紫外扫描、质谱以及核磁共振等实验证明菌株Slf14可合成石杉碱甲。内生真菌Slf14发酵条件的研究表明,在PDA培养基中加入酵母膏5 g/L、KH2PO4 1.0g/L、MgSO4 0.3g/L、KNO3 0.5g/L、KCl 0.5g/L;培养温度28°C、接种量10%、初始pH值5.5、摇床转速140r/min,培养14d,在这样的条件下石杉碱甲产量达到0.66mg/L,最高达到0.75mg/L。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-9
第一章 前言  9-17
  1.1 植物内生真菌研究现状  9-13
    1.1.1 植物内生真菌分布及与宿主关系  10
    1.1.2 植物内生真菌的生物学作用  10-11
    1.1.3 药用植物内生真菌的开发与应用  11-12
    1.1.4 植物内生真菌的前景展望  12-13
  1.2 蛇足石杉及其药用成分的研究进展  13-15
    1.2.1 蛇足石杉简介  13
    1.2.2 石杉碱甲(huperzine A)  13-14
    1.2.3 石杉碱甲(huperzine A)的主要来源  14-15
    1.2.4 石杉碱甲(huperzine A)的前景展望  15
  1.3 论文研究的目的及意义  15-17
第二章 药用植物蛇足石杉内生真菌的分离与保藏  17-23
  2.1 实验材料  17-18
    2.1.1 供试植物材料  17
    2.1.2 仪器与试剂  17-18
    2.1.3 培养基配制  18
  2.2 实验方法  18-19
    2.2.1 材料清理、洗涤及表面灭菌  18
    2.2.2 蛇足石杉内生真菌的分离和纯化  18
    2.2.3 蛇足石杉内生真菌菌种的保存  18-19
  2.3 结果与分析  19-21
    2.3.1 蛇足石杉的植株形态  19-20
    2.3.2 分离到的内生真菌数目与培养时间  20
    2.3.3 内生真菌在蛇足石杉不同器官中的分布  20-21
  2.4 讨论  21-23
    2.4.1 内生真菌分离过程中的培养基  21
    2.4.2 内生真菌分离过程中的蛇足石杉植物体表面消毒  21
    2.4.3 蛇足石杉内生真菌在不同器官中的分布  21-22
    2.4.4 蛇足石杉内生真菌分离过程中培养时间的选择  22-23
第三章 抑制乙酰胆碱酯酶活性菌株的筛选  23-29
  3.1 实验材料  23
    3.1.1 菌株  23
    3.1.2 主要仪器与试剂  23
    3.1.3 培养基配制  23
  3.2 实验方法  23-25
    3.2.1 蛇足石杉内生真菌的培养  23-24
    3.2.2 蛇足石杉内生真菌发酵代谢产物的提取  24
    3.2.3 内生真菌发酵样品的活性筛选  24-25
  3.3 结果与分析  25-27
    3.3.1 AChE 活性检测条件优化结果  25-26
    3.3.2 蛇足石杉内生真菌发酵液醇提物的AChE 抑制活性筛选结果  26-27
  3.4 讨论  27-29
第四章 蛇足石杉内生真菌Slf14 鉴定及代谢产物初步研究  29-43
  4.1 实验材料  29-30
    4.1.1 菌株  29
    4.1.2 培养基配方  29
    4.1.3 主要试剂与仪器  29-30
  4.2 实验方法  30-33
    4.2.1 菌株形态观察及固体插片培养  30
    4.2.2 种子液配置与液体摇瓶培养  30
    4.2.3 蛇足石杉内生真菌Slf14序列的测定比对  30-31
    4.2.4 菌体Slf14 发酵代谢产物研究  31-33
  4.3 结果与分析  33-41
    4.3.1 蛇足石杉内生真菌Slf14 平板形态观察结果  33
    4.3.2 蛇足石杉内生真菌Slf14 显微形态观察结果  33-34
    4.3.3 蛇足石杉内生真菌Slf14 摇瓶形态观察结果  34
    4.3.4 蛇足石杉内生真菌Slf14 的分子生物学鉴定  34-36
    4.3.5 薄层层析（TLC）  36
    4.3.6 高效液相色谱（HPLC）分析  36-39
    4.3.7 质谱分析  39
    4.3.8 核磁共振分析  39-41
  4.4 讨论  41-43
    4.4.1 薄层层析展开剂的选择  41
    4.4.2 影响生物碱提取的因素  41-43
第五章 竹黄菌Slf14 产石杉碱甲发酵条件的研究  43-51
  5.1 实验材料  43
    5.1.1 菌株  43
    5.1.2 培养基配方  43
    5.1.3 主要试剂与仪器  43
  5.2 实验方法  43-44
    5.2.1 竹黄菌Slf14 发酵培养特性研究  43-44
    5.2.2 碳源、氮源的选择  44
    5.2.3 无机盐的优化  44
    5.2.4 发酵条件的优化  44
  5.3 结果与分析  44-49
    5.3.1 菌株Slf14 的发酵培养特性  44-45
    5.3.2 碳源、氮源的选择  45-46
    5.3.3 无机盐的优化  46-48
    5.3.4 发酵条件的优化  48-49
    5.3.5 验证试验  49
  5.4 讨论  49-51
结论  51-53
参考文献  53-57
致谢  57-58
在读期间公开发表论文（著）及科研情况  58

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药化学
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