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稀缺药用植物小蔓长春花产活性成分内生真菌的研究

作　者: 孙宇宏
导　师: 殷红
学　校: 西北大学
专　业: 微生物学
关键词: 小蔓长春花内生真菌长春胺发酵条件菌种鉴定
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

采用常规的真菌分离方法,从稀缺药用植物小蔓长春花中分离出了10株内生真菌,并以此为对象进行以下研究工作。根据生物碱类化合物所具有的颜色反应,初步筛选出1株可能产生生物碱类化合物的菌株XM J2。通过TLC条件的筛选,选用异丙醚-二甲苯-丙酮-甲醇（2∶2∶1∶0.2）作为展开剂,用改良碘化铋钾作为显色剂,进一步检测XM J2产生生物碱的能力,并利用R_f值初步定性。结果表明XM-J2的代谢物与长春胺标准品在同一色谱条件下具有相同的R_f值。扩大培养XM-J2,提取菌株的代谢物,利用硅胶柱层析精制,洗脱剂为50%甲醇,洗脱液在长春胺特征吸收波长λ=269nm下进行检测。收集在此波长下吸光度较大的洗脱液,挥干溶剂后得到XM-J2代谢物精制样品。利用HPLC对比精制样品和长春胺标准品保留时间,并检测样品纯度,在保证样品纯度大于90%的基础上利用结构确证常用方法,通过红外、紫外、1H-NMR、H-HCOSY谱图考察样品与目标化合物长春胺分子结构的相似程度。实验结果表明:柱层析后的精制样品中存在与长春胺标准品保留时间相一致的物质峰;提取物的紫外、红外谱图与文献报道的长春胺标准品谱图一致;¹H-NMR谱图解析后得到的分子氢骨架与长春胺分子结构相一致,综合以上可以确定XM-J2菌株代谢物中存在长春胺物质。通过对不同固体培养基中菌落的生长速率和长势进行比较,发现在马铃薯蔗糖培养基上该菌生长较快。通过对不同液体培养基中XM-J2的生物量和长春胺产生量的列比,筛选出适合XM-J2菌丝生长及产物长春胺合成的马铃薯蔗糖液体培养基。在该培养基中,当菌株发酵液中菌丝体干重最大时长春胺产率为0.64 mg·L^-1。单因素分析实验初步确定实验室发酵XM-J2菌株的最佳碳源、氮源和温度分别是蔗糖、蛋白胨和28℃。通过正交实验优化XM-J2的发酵条件,得出适宜菌丝生长且利于代谢物积累的发酵条件培养基配比为蔗糖50g·L^-1,蛋白胨1g.L^-1.装量为85～90ml/250ml,PH7.0左右,培养温度28℃,转速80r/min。根据XM-J2菌株的显微结构特征,对XM-J2菌株进行了分类,初步确定为:真菌门,半知菌类,丝孢纲,无孢目。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-9
第一章文献综述  9-21
  1. 稀缺药用植物小蔓长春花及长春胺的研究概况  9-16
    1.1 小蔓长春花研究的历史  9
    1.2 小蔓长春花的生物学特性及种苗繁殖  9-10
      1.2.1 植物形态特征  9-10
      1.2.2 生物学特性  10
      1.2.3 组织培养和种苗繁殖  10
    1.3 长春胺的化学特性  10-12
    1.4 长春胺的临床药用价值  12-13
      1.4.1 长春胺的药理作用  12
      1.4.2 长春胺的临床应用特点  12-13
      1.4.3 长春胺药物临床应用展望  13
    1.5 小蔓长春花近几年的研究进展  13-16
      1.5.1 利用生物技术手段提高小蔓长春花中长春胺的含量  13-14
      1.5.2 利用现代分离技术提高小蔓长春花植物材料的提取效率  14-16
      1.5.3 小蔓长春花有效成分长春胺衍生药品的发展  16
  2. 植物内生真菌研究进展  16-20
    2.1 植物内生真菌与宿主的相互关系  16-17
    2.2 内生真菌的多样性  17-18
    2.3 内生真菌产生药用活性成分机制  18
    2.4 内生真菌的活性成分和应用展望  18-20
  3. 本论文研究的内容、目的和意义  20-21
第二章产活性成分内生真菌的初步筛选  21-30
  1. 材料与方法  21-23
    1.1 实验材料  21
    1.2 试剂  21
    1.3 仪器  21
    1.4 培养基  21
    1.5 实验方法  21-23
      1.5.1 内生真菌的分离  21-22
      1.5.2 产活性成分内生真菌的初筛  22-23
        1.5.2.1 种子液的制备  22
        1.5.2.2 生长曲线测定  22
        1.5.2.3 培养物的处理  22
        1.5.2.4 生物碱的定性检测  22-23
  2. 实验结果与讨论  23-30
    2.1 小蔓长春花内生真菌的分离结果  23-27
    2.2 小蔓长春花内生真菌的生长曲线  27-28
    2.3 生物碱类物质的定性反应  28-30
第三章小蔓长春花内生真菌菌株的复筛及有效物质鉴定  30-50
  1. 材料与方法  30
    1.1 菌种  30
    1.2 培养基  30
    1.3 试剂  30
    1.4 仪器  30
    1.5 标准品  30
  2. 实验方法  30-34
    2.1 薄层层析实验方法的确定  30-31
      2.1.1 供试样品溶液的制备  30-31
      2.1.2 TLC条件的选择  31
      2.1.3 TLC实验  31
    2.2 有效成分长春胺在菌体内外的分布情况  31
    2.3 有效成分长春胺提纯精制方法  31-32
    2.4 对目的菌株代谢产物结构对比确证  32-34
      2.4.1 HPLC对代谢物简单定性和精制样品纯度分析  32-33
      2.4.2 红外光谱(IR)分析  33
      2.4.3 核磁共振(NMR)分析  33
      2.4.4 紫外光谱(UV)分析  33-34
  3. 实验结果与讨论  34-50
    3.1 薄层层析检测结果  34
    3.2 长春胺在菌体内外分布情况  34
    3.3 发酵液提取物柱层析提取结果及讨论  34-35
    3.4 目的菌株代谢产物结构对比确证  35-50
      3.4.1 HPLC结果分析  36-39
      3.4.2 红外光谱检测结果分析  39-43
      3.4.3 核磁共振检测结果分析  43-50
      3.4.4 紫外光谱检测结果分析  50
第四章 XM-J2菌株发酵条件的优化  50-61
  1. 实验材料及仪器  50
    1.1 菌株  50
    1.2 培养基  50
    1.3 试剂  50
    1.4 主要仪器  50
  2. 实验方法  50-52
    2.1 标准曲线绘制  50-51
    2.2 固体培养基的选择  51
    2.3 液体培养基的选择  51
    2.4 发酵条件的单因素分析  51-52
      2.4.1 氮源的选择  51
      2.4.2 碳源选择  51
      2.4.3 温度选择  51-52
    2.5 发酵条件的优化  52
    2.6 XM-J2菌株的初步分类  52
  3. 实验结果和讨论  52-61
    3.1 长春胺的标准曲线制作  52
    3.2 固体培养基的选择结果  52-53
    3.3 液体培养基的选择结果  53-55
    3.4 发酵条件的单因素分析结果  55-57
      3.4.1 氮源选择  55-56
      3.4.2 碳源选择  56-57
      3.4.3 最适温度  57
    3.5 XM-J2菌株发酵条件的优化  57-59
    3.6 XM-J2菌株的初步分类  59-61
小结  61-62
参考文献  62-66
致谢  66

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