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四种石杉科植物中产生石杉碱甲的内生真菌的分离、鉴定和其石杉碱甲含量的测定

作　者: 鞠錾
导　师: 潘胜利
学　校: 复旦大学
专　业: 生药学
关键词: 内生真菌石杉碱甲石杉科蛇足石杉超声提取血管性痴呆实验研究除杂质提取液代谢产物阿尔茨海默病 Blastomyces 分离纯化组织培养药理实验平板划线法显微形态特征菌种鉴定植物资源千层塔
分类号: R284.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

痴呆是由于脑功能障碍而产生的获得性智能损害综合症。通常引起痴呆的原因包括变性病性和非变性病性,前者主要包括阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease, AD)和额颞痴呆等；后者主要包括血管性痴呆、感染性痴呆、代谢性和中毒性脑病。其中以阿尔茨海默型痴呆和血管性痴呆。老年痴呆,心、脑血管疾病和恶性肿瘤已成为老年人致残、致死的四大疾病。而老年痴呆症已成为常见的死亡原因的第四位。20世纪80年代初,我国科学家首先从中国民间草药“千层塔”中分离到石杉碱甲(Huperzine A),经药理实验证明它是一种低毒、高效、可逆和高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂,有强效、高选择性的抗乙酰胆碱酯酶活性及提高学习和改善老年人记忆功能的作用。目前已有新药上市,广泛用于阿尔茨海默病和血管性痴呆的治疗。到目前为止,石杉碱甲仅发现存在于石杉科植物中。石杉科植物是现存的最古老的蕨类植物类群之一,曾繁盛于古生代,后随种子植物的崛起而大多灭绝。现残存的种类,绝大部分为腐生或寄生,多分布于人迹罕至的原始森林中,且生长缓慢、植株矮小,对空气、光照、温度、湿度等因素要求苛刻。近年来,随着石杉碱甲被分离并广泛应用于临床,掀起了研究开发的热潮,对其需求也越来越大,人们便开始对石杉科植物的掠夺式开发,再加上其它因素如生态环境恶化等的威胁,使其资源越来越匮乏。目前尽管报道了多种石杉碱甲的全合成方法,但是价格昂贵,步骤繁琐,基本没有实用价值。石杉科植物中存在多种内生真菌,内生真菌种类繁多,在寄主植物组织内部的生长发育过程中,其代谢产物对植物体本身有着各种各样的影响。本文选取了四种石杉科植物并对其的内生真菌进行研究,得到产生石杉碱甲的内生真菌,根据显微形态对菌种进行了初步鉴定,改进筛选内生真菌的培养条件,并建立了HPLC方法来检测内生真菌代谢产物中的石杉碱甲的含量。另外,本文还使用组织培养方法来培养石杉科植物。1.四种石杉科植物的内生真菌的培养和分离选用四种含有石杉碱甲的石杉科植物：蛇足石杉,长柄石杉,伏贴石杉,柳杉叶马尾杉,对其进行灭菌等处理经培养得到内生真菌,采用平板划线法进行菌种分离纯化,并对真菌进行观察,拍照记录。反复实验中得到适合筛选内生真菌的培养基为MS培养基和培养温度为28℃。2.样品处理和石杉碱甲含量测定方法利用得到的内生真菌的样品和石杉碱甲标准品,经反复实验确定了HPLC的测定方法,发现了2株内生真菌能够产生石杉碱甲,并测定了真菌样品中石杉碱甲含量。3.内生真菌菌种鉴定观察并记录内生菌落培养特征和显微形态特征,对照有关资料确定真菌的分类学地位。这两个菌株分别为芽胞菌属(Blastomyces Cost. ex Roll.),葡萄孢属(Botrytis Pers.ex Fr.)。4.石杉碱甲检测条件优化比较了提取液经碱化再用有机溶剂萃取除杂质和直接测定提取液的效果。考察了超声提取时间和不同提取溶剂对提取效果的影响；还考察了不同紫外检测波长对检测的影响,得出最优化检测条件为：采用酒石酸超声1h提取,经碱化后用氯仿萃取,测定的波长为310nm。并发现该优化的条件适合更多石杉类内生真菌样品的测定。5.石杉科植物的组织培养选取七种石杉科植物的茎叶和孢子,采用组织培养的方法对其灭菌和培养。结果发现茎叶的组织培养均未发现愈伤组织生成,孢子培养也非常缓慢,仅有华南马尾杉的孢子在8个月后萌发。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
前言  10-11
第一章概论  11-20
  第一节早老性痴呆治疗药物的研究进展  11-14
    1 、早老性痴呆  11
    2 、早老性痴呆药物现状  11-13
    3 、石杉科植物  13
    4 、内生真菌  13-14
  第二节内生真菌的研究进展  14-20
    1 、内生真菌的基本特征  14-15
      1.1. 内生真菌的种类、分布  14
      1.2. 内生真菌的多样性  14-15
    2 、内生真菌的生物学作用  15-16
      2.1. 抗癌药物资源  15
      2.2. 抗菌药物  15-16
      2.3. 内生真菌产生的其他活性物质  16
    3 、内生真菌研究面临的问题  16-17
    4 、结论  17
    5 、参考文献  17-20
第二章内生真菌的培养和分离  20-31
  1 、实验所用的材料  20-23
    1.1. 植物材料  20-23
    1.2. 实验所用的培养基  23
  2 、实验所用的仪器设备和试剂  23-24
    2.1. 实验所用的仪器  23-24
    2.2. 实验所用的试剂材料  24
  3 、实验方法  24-26
    3.1. 石杉材料处理及内生真菌的获得  24-26
    3.2. 内生真菌的分离纯化  26
  4 、实验结果  26-29
    4.1. 内生真菌的观察  26-28
    4.2. 不同培养基对真菌培养的影响及培养温度选择  28-29
      4.2.1. 内生真菌的筛选  28-29
      4.2.2. 内生真菌的继代培养  29
      4.2.3. 不同培养温度对真菌培养基的影响  29
  5 、讨论  29
  6 、参考文献  29-31
第三章样品处理和石杉碱甲含量测定方法  31-43
  1、材料、试剂与仪器  31-32
  2 、实验方法  32-41
    2.1. 样品处理方式  32
      2.1.1. 样品前处理  32
      2.1.2. 样品处理方式的选择  32
    2.2. 色谱条件选择  32-37
      2.2.1. 紫外检测波长的选择  33-34
      2.2.2. 流动相的选择  34-37
    2.3. 方法学考查  37-38
      2.3.1. 对照品溶液的配制  37
      2.3.2. 标准曲线的绘制  37
      2.3.3. 精密度  37
      2.3.4. 稳定性试验  37
      2.3.5. 回收率考察  37-38
    2.4. DAD检测器检测标准品与样品的全波长扫描  38-41
  3 、结果与分析  41
    3.1. 内生真菌产生的石杉碱甲的含量测定  41
    3.2. 紫外全波长扫描  41
  4 、讨论  41-42
  5 、参考文献  42-43
第四章内生真菌菌种鉴定  43-48
  1 、仪器和染色材料  43
  2 、内生真菌显微特征观察  43-45
    2.1. 棉蓝染色液配制  43
    2.2. 制片  43-44
    2.3. 显微观察与拍照  44
    2.4. 观察菌落培养特征和显微特征  44-45
  3 、内生真菌鉴定  45-46
  4 、讨论  46-47
  5 、参考文献  47-48
第五章石杉碱甲检测条件优化  48-54
  1 、内生真菌样品前处理  48-49
    1.1. 显微观察与拍照  48
    1.2. 结果与分析  48-49
  2、内生真菌样品的提取方法与真菌的破壁  49-50
    2.1. 方法  50
    2.2. 结果  50
  3、提取方法中超生时间考察  50-51
    3.1. 方法  50-51
    3.2. 结果  51
  4、紫外检测波长的优化  51-53
    4.1. 方法  51
    4.2. 结果  51-53
  5、讨论  53
  6、参考文献  53-54
第六章石杉科植物的组织培养  54-60
  1、石杉科植物的组织培养  54-57
    1.1. 实验所用的材料  54-56
    1.2. 实验所用的仪器和试剂  56
    1.3. 实验所用的试剂材料  56-57
  2、实验方法  57-58
    2.1. 灭菌  57
    2.2. 孢子培养  57
    2.3. 茎叶的培养  57-58
  3、结果与分析  58-59
    3.1. 灭菌效果  58
    3.2. 内生真菌生长部位的推断  58
    3.3. 茎叶的组织培养  58
    3.4. 孢子的组织培养  58-59
  4、讨论  59
  5、参考文献  59-60
结语  60-61
致谢  61-62

四种石杉科植物中产生石杉碱甲的内生真菌的分离、鉴定和其石杉碱甲含量的测定

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