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黄芩内生真菌的初步研究

作　者: 张黎光
导　师: 魏希颖
学　校: 陕西师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 黄芩内生真菌黄芩苷正交优化
分类号: S567.239
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

植物内生真菌是指那些生活史的全部或某一时期生活在健康植物组织内而对其不引起明显病症的真菌。近年来的研究表明,部分内生真菌能够产生与宿主植物相同或相似的生物活性物质,从而成为新药的来源之一。作为一种新型的微生物资源,植物内生真菌次生代谢产物在生物制药、病虫害的生物防治和工业发酵等方面的应用逐渐成为研究的热点。黄芩是传统的常用药材之一,具有镇静、降压、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等功效,主治温热病、上呼吸道感染、肺热咳嗽、湿热黄胆、肺炎、痢疾等症。本文以药用植物黄芩为对象,对其内生真菌进行了初步研究,结果如下：(1)采用常规微生物分离方法从药用植物黄芩的健康无病害组织中分离得到17株内生真菌,其中根部3株,茎部7株,叶1株,花6株。(2)采用杯碟法测定了黄芩内生真菌发酵液对大肠杆菌(Escherichia coli) A70、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)A99、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 26003等10种指示细菌的抑菌活性。试验结果表明,多数内生真菌发酵液对至少一种指示细菌有不同程度的抑制活性,其中有4株内生真菌(J1 J4 J5 G2)对多种指示细菌显示出较广的抗菌谱。(3)利用薄层层析(TLC)和高效液相色谱(HPLC)分析的方法检测内生真菌代谢产物。TLC检测结果表明,有2株内生真菌(J1和H3胞内)代谢产物与标准品黄芩苷具有相同的Rf值,进一步的HPLC检测结果表明,J1和H3代谢产物与黄芩苷标准品具有相同的保留时间。初步判断,菌株J1与H3可以产生与宿主植物黄芩相同的活性成分黄芩苷。(4)根据J1及H3菌株的菌落形态特征及显微观察,结合ITS核酸序列分析,初步鉴定菌株J1及H3均属于半知菌门的青霉种属。(5)选取产黄芩苷含量较高的J1菌株进行培养基和培养条件的优化。通过比较J1菌株在常用液体培养基中的菌丝体生长和黄芩苷的产生情况,发现豆芽汁液体培养基既有利于菌丝体生长又有利于黄芩苷的积累。通过单因素分析优化实验室发酵J1菌株的培养基,确定其最佳C源、N源分别是蔗糖和硝酸铵。由菌株J1的发酵条件正交优化结果得知,在所选的三个因素中,C源浓度对生物量影响最大,N源浓度次之,pH值影响最小。对黄芩苷产量影响最大的因素为C源浓度,N源浓度次之,pH值影响最小。通过正交优化实验得出J1菌株的优化发酵条件如下：为获得最大生物量,应使蔗糖的浓度为4.0%,硝酸铵的浓度为0.15%,pH为7.0；为获得黄芩苷的最大产量,蔗糖的浓度为4.0%,硝酸铵的浓度为0.25%,pH为6.0。因为正交结果表明适合黄芩苷累积的条件与菌丝体的生长条件有所差异,最终优化的发酵培养方式为：先以有利于菌丝生长的培养基培养,待菌株进入稳定期后,可以适当增大N源浓度,降低pH值来提高黄芩苷的产量。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-10
第一章文献综述  10-22
  1.1 黄芩研究概况  10-13
    1.1.1 黄芩的形态特征  10
    1.1.2 黄芩资源分布  10-11
    1.1.3 黄芩的主要药用成分  11
    1.1.4 黄芩的药理作用  11-12
    1.1.5 黄芩活性成分的检测鉴定方法  12-13
  1.2 内生真菌研究概述  13-21
    1.2.1 内生真菌的概念  13-14
    1.2.2 植物内生真菌的普遍性及其生物多样性  14
    1.2.3 植物内生真菌与宿主的关系  14-16
    1.2.4 内生真菌对天然产物的结构转化  16
    1.2.5 药用植物内生真菌产生与宿主相同或相似成分机制  16-17
    1.2.6 药用植物内生真菌代谢产物的研究  17-20
    1.2.7 内生真菌研究过程中存在的问题及展望  20-21
  1.3 本论文研究的内容、目的、意义  21-22
第二章黄芩内生真菌的分离、纯化  22-26
  2.1 材料与试剂  22-23
    2.1.1 材料  22
    2.1.2 试剂  22
    2.1.3 培养基  22
    2.1.4 主要仪器设备  22-23
  2.2 实验方法  23
  2.3 结果  23-24
  2.4 讨论  24-26
第三章黄芩内生真菌抑菌活性的研究  26-30
  3.1 材料与试剂  26-27
    3.1.1 材料  26
    3.1.2 试剂  26
    3.1.3 仪器  26-27
    3.1.4 培养基  27
  3.2 实验方法  27
    3.2.1 待测内生真菌菌株的液体发酵培养  27
    3.2.2 供试指示细菌菌悬液的制备  27
    3.2.3 内生真菌发酵液抑菌活性的测定  27
  3.3 结果  27-29
  3.4 讨论  29-30
第四章产活性成分黄芩苷内生真菌的筛选  30-36
  4.1 材料与方法  30-31
    4.1.1 实验材料和标准品  30
    4.1.2 试剂  30
    4.1.3 主要仪器设备  30
    4.1.4 标准品溶液的制备  30-31
  4.2 实验方法  31-32
    4.2.1 发酵液的预处理  31
    4.2.2 薄层层析分析法(TLC)初筛产黄芩苷的菌株  31
    4.2.3 HPLC法复筛产黄芩苷的菌株  31-32
  4.3 结果  32-34
    4.3.1 TLC法初筛产黄芩苷菌株的结果  32-33
    4.3.2 HPLC法复筛产黄芩苷菌株的结果  33-34
  4.4 讨论  34-36
第五章产黄芩苷内生真菌菌株的鉴定  36-44
  5.1 材料与方法  36
    5.1.1 实验材料  36
    5.1.2 试剂  36
    5.1.3 主要仪器设备  36
  5.2 实验方法  36-38
    5.2.1 产黄芩苷菌株的形态学鉴定  36-37
    5.2.2 产黄芩苷菌株的分子生物学鉴定  37-38
  5.3 结果  38-43
    5.3.1 产黄芩苷菌株的形态学鉴定  38-40
    5.3.2 产黄芩苷菌株的分子生物学鉴定结果  40-43
  5.4 讨论  43-44
第六章产黄芩苷内生真菌菌株发酵条件的优化  44-58
  6.1 材料与方法  44-45
    6.1.1 菌株来源  44
    6.1.2 培养基  44
    6.1.3 标准品溶液的制备  44
    6.1.4 主要仪器设备  44-45
  6.2 实验方法  45-47
    6.2.1 黄芩苷紫外吸收标准曲线的绘制  45
    6.2.2 基本培养基的选择  45
    6.2.3 发酵条件的单因素选择  45-46
    6.2.4 发酵条件的优化  46
    6.2.5 优化前后菌株生物量和黄芩苷含量的变化  46-47
  6.3 结果与讨论  47-58
    6.3.1 黄芩苷标品紫外吸收标准曲线  47
    6.3.2 基本培养基的选择  47-51
    6.3.3 发酵条件的单因素选择  51-54
    6.3.4 发酵条件的正交优化  54-56
    6.3.5 优化前后菌株生物量和黄芩苷产量的变化  56-58
第七章小结  58-60
参考文献  60-68
致谢  68-70
攻读学位期间研究成果  70

黄芩内生真菌的初步研究

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