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HD5与GLP2表达载体构建及其对放烧伤小鼠肠源性感染的影响

作　者: 谭虎
导　师: 杨天德
学　校: 第三军医大学
专　业: 麻醉学
关键词: 肠源性感染人防御素5 人胰高血糖素样肽2 基因重组多基因表达肠上皮内毒素细菌移位氯胺酮壳聚糖纳米粒 Cre重组酶 LoxP位点
分类号: R644
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

背景：肠道是人体最大的“储菌所”和“内毒素库”，在机体受到严重创伤时，细菌和内毒素可经肠道侵入而播散至全身，形成“肠源性感染”。创伤后肠道损伤主要表现为以下三方面：1、肠绒毛上皮细胞广泛性坏死、脱落，肠道机械屏障破坏；2、肠粘膜免疫细胞数量减少，功能抑制；3、肠道菌群失调，微生态严重破坏；从而引起肠道菌大量入侵，对全身造成二次打击，促使继发多器官功能不全综合症(MODS)形成。因此，肠源性感染是否得到控制将直接影响严重创伤患者的预后。对此，目前尚无有效治疗措施。以前研究均集中从单一方面着手，很少考虑联合治疗，故虽取得一定疗效，却不够理想，如能在控制肠源性感染时做到“双管齐下”，即有效促进肠上皮结构修复、功能恢复、同时增强肠粘膜免疫功能，则可从根本上防治肠道损害。目的：本课题通过构建双基因表达质粒，经壳聚糖口服转染至肠上皮，于损伤局部表达有促增值效应的胰高血糖素样肽2(glucagon-like peptid-2，GLP-2)和有抗感染效应的人类防御素5(human defensin 5；HD5)，观察其对创伤后肠源性感染的影响，旨在建立一种防治肠源性感染和其他原因引起的类似肠道损害的方法，避免MODS的发生和发展。方法：本课题选取了促肠上皮细胞增殖的特异性调节因子GLP-2及肠道天然免疫成分HD-5；采用基因克隆技术首先将GLP-2进行定点突变，以防止被DPP-Ⅳ酶解失活并提高其活性；并在GLP-2和HD-5两端设计Cre重组酶 LoxP位点序列，用于适时基因表达关闭；然后将“LoxP-GLP-2基因(经修饰)-HD-5基因-LoxP”克隆入多基因表达载体(Multigenic Expression Vector)，以壳聚糖纳米粒包裹质粒，并灌服放烧复合伤的模型动物。通过RT-PCR方法检测了动物肠组织中转染基因mRNA表达情况，通过光学显微镜、扫描电镜、及透射电镜系统观察了肠上皮治疗前后的形态结构变化，并检测了肠系膜淋巴结、肝和血中的细菌移位情况及血中内毒素浓度。在此基础上还第三军医大学硕士学位论文进一步研究了氯胺酮麻醉与该治疗方法联合应用时对其的影响。结果: l、通过RT一PCR方法，从癫痛患者的脑组织总RNA中获得高血糖素原基因序列，测序结果显示序列完全正确。 2、通过PCR重组技术，获得了HD一5的目的基因片段，测序结果显示己成功将信号肤和成熟肤序列拼接起来，并加入了Lox一P序列。GLP一2也得到了相同结果，而且编码其成熟肤N一末端第二位氨基酸的序列已由丙氨酸(GCT)突变为甘氨酸(GGT)，提示定点突变成功。 3、重组表达质粒pvrrR03一HDS一GLPZ酶切分析提示插入片段方向正确，测序结果显示序列完全正确，可用于下一步的基因治疗实验。 4、肠上皮细胞Cac小2进行重组质粒脂质体转染后，RT一PCR显示阳性克隆中有HD一5和GLP一2 mRNA的表达，提示重组质粒转染成功并得到成功转录;M竹证实含rGLP一2的培养上清可明显促进Cac。一2细胞增殖。 5、壳聚糖形成的纳米粒大小均匀，DNA包封率高，能有效抵抗DNA酶I降解;介导pEGFP基因转移后，通过荧光显微镜能观察到有绿色荧光蛋白产生，但表达量低于脂质体转染对照组。 6、口服重组质粒壳聚糖纳米粒后，RT一PCR方法检测到实验小鼠肠上皮组织有HD一5和GLP一2 nlRNA的表达;光学显微镜、扫描电镜及电子显微镜均提示，重组质粒治疗组的肠上皮形态结构修复较对照组明显提前，表现为绒毛高度增加，密度增加，排列整齐，各细胞器损伤明显减轻;移位细菌及内毒素检测提示移位至淋巴结、肝、血中的细菌明显减少，血浆内毒素浓度明显降低。而加用氯胺酮对该治疗效应无明显影响。结论: 1.通过PCR重组技术可以成功地将编码信号肤和成熟肤的序列拼接起来，适用于分泌性载体的构建。 2.双顺反子构建的多基因表达质粒可成功携带多个基因并能同时高效表达，适用于多基因表达策略。 3.壳聚糖纳米粒可用于经口服途径的肠道基因转染。 4.通过壳聚糖纳米粒将能表达rHD一5和rGLP一2的双基因表达质粒转移至肠上皮能有效减轻创伤后肠道损害，减少肠源性感染的发生。 5．氯胺酮对肠结构和功能无明显影响，可安全地与该基因治疗方法合用于创伤病人的救治。

全文目录

英文缩写一览表  5-6
英文摘要  6-9
中文摘要  9-12
论文正文 HD5与GLP2表达载体构建及其对放烧伤小鼠肠源性感染的影响  12-93
  前言  12-14
  第一部分 pVITRO3-HD5-GLP2重组质粒的构建  14-34
    实验一高血糖素原cDNA片段的获取及GLP-2目的片段的克隆  14-24
      材料  14-15
      方法  15-20
      结果  20-24
    实验二 HD-5目的片段的克隆  24-28
      材料  24
      方法  24-26
      结果  26-28
    实验三重组质粒pVITRO3-HD5-GLP2的构建  28-34
      材料  28
      方法  28-30
      结果  30-32
      讨论  32-34
  第二部分重组质粒pVITRO3-HD5-GLP2对小鼠放烧复合伤肠源性感染防治的实验研究  34-52
    材料  34
    方法  34-39
    结果  39-48
    讨论  48-52
  全文结论  52-53
  致谢  53-54
  图片  54-87
  参考文献  87-93
文献综述胰高血糖素样肽-2的研究进展  93-113
  参考文献  103-113
研究生期间发表或交流的论文  113

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