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融合基因（RGD）_3-DAB_（391）原核表达载体的构建及表达与体外肿瘤抑制效应探讨

作　者: 张逸群
导　师: 马丁
学　校: 华中科技大学
专　业: 妇产科学
关键词: (RGD)3- DAB391融合蛋白 RGD肽 MCF-7细胞 MDA-MB-231细胞乳腺癌 Prox1 肿瘤转移淋巴管内皮细胞
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

【目的】本研究主要探讨RGD肽与受体区缺失的白喉毒素前391个氨基酸(DAB391)通过基因重组的方法所构建的融合基因表达与效应验证以及和环状RGD肽之间的功能比较。通过对乳腺癌细胞株MCF-7及MDA-MB-231增殖及凋亡过程的影响,探讨其在靶向性肿瘤治疗中的作用机制。【方法】通过基因重组的方法构建特异性靶向分子(RGD- RGD- RGD)- DAB391(以下简写为(RGD)3- DAB391)的原核表达载体以及不含RGD序列的DAB391原核表达载体,选择性的诱导其蛋白的表达,以Ni2+-NTA亲和层析的方法对表达的蛋白进行纯化,纯化后的蛋白复性后通过体外细胞学检测其功能。以MTT法比较不同分子对肿瘤细胞的增殖抑制效应,通过流式细胞学技术检测其对肿瘤细胞的凋亡诱导作用差异。【结果】成功构建了重组的原核表达载体(RGD)3- DAB391/pET-28a,经过IPTG诱导后可表达相对分子量约为45000的目的蛋白,其产量约占大肠杆菌总蛋白的25%。将表达产物经过变性、纯化之后可以得到约为90%纯度的(RGD)3- DAB391融合蛋白。采用还原/氧化体系复性的方法,最终获得了一定数量的有活性蛋白:(RGD)3- DAB391。同样也得到了部分有活性的DAB391蛋白。重组的(RGD)3- DAB391融合蛋白及RGD肽均对肿瘤细胞具有一定的增殖抑制作用,且融合蛋白的作用更强(P<0.01);上述两种分子均可增加肿瘤细胞的凋亡,且融合蛋白的效应更明显(P<0.01)。复性后的DAB391蛋白则对上述两种肿瘤细胞无明显作用(P>0.05)【结论】成功构建并获得有活性的(RGD)3- DAB391融合蛋白,其显示出了强于RGD肽的肿瘤杀伤效应,为进一步研究小分子导向肽在恶性肿瘤的靶向治疗应用方面提供了新的思路。【目的】探讨Prox1在乳腺癌组织中的表达及其与各临床病理因素的关系。【方法】采用免疫组织化学SP法检测11例良性乳腺增生组织和80例浸润性乳腺导管癌组织(其中30例合并转移淋巴结,50例无转移淋巴结)中Prox1的表达。【结果】Prox1在良性乳腺增生组织中均为阴性表达,在乳腺癌组织中癌细胞和淋巴管内皮细胞的表达阳性率分别为62.5%(50/80)和65.0%(52/80),其中有淋巴结转移组阳性率分别为76.7% (23/30)和83.3% (25/30),明显高于无淋巴结转移组阳性率54.0% (27/50)和54.0% (27/50),两组间的差异有统计学意义(P<0.05);且在有转移组,淋巴管内皮细胞Prox1的表达与淋巴结转移数目有关(P<0.05),但其表达与ER、PR、HER-2以及年龄无关。在乳腺癌组织中癌细胞与淋巴管内皮细胞Prox1的表达呈正相关(r=0.452, P<0.001),且二者的表达均与TNM分期呈正相关(r=0.589, P<0.001)。【结论】Prox1在乳腺癌组织中的高表达可能与乳腺癌淋巴道转移密切相关。

全文目录

第一部分融合基因(RGD)3- DA8391原核表达载体的构建及表达与体外肿瘤抑制效应探讨  5-39
  一、研究背景  5-7
  二、技术路线和实验流程  7-8
  三、中文摘要  8-9
  四、英文摘要  9-11
  五、前言  11-12
  六、材料与方法  12-26
  七、实验结果  26-34
  八、讨论  34-36
  九、参考文献  36-39
第二部分 Prox1 在乳腺癌组织中的表达及其与淋巴道转移的关系  39-52
  一、中文摘要  39-40
  二、英文摘要  40-41
  三、前言  41
  四、材料与方法  41-42
  五、实验结果  42-47
  六、讨论  47-50
  七、参考文献  50-52
第三部分综述：整合素与肿瘤显像及靶向治疗的临床现状研究  52-63
  参考文献  59-63
致谢  63-64

融合基因（RGD）_3-DAB_（391）原核表达载体的构建及表达与体外肿瘤抑制效应探讨

内容摘要

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