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甘氨酸的细胞保护作用及机制研究

作　者: 秦霞
导　师: 陈琪
学　校: 南京医科大学
专　业: 病理生理学
关键词: 甘氨酸 FoxO1 自噬 AMPK 缺氧
分类号: R965
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


目的:明确Akt下游核转录因子FoxO1（Forkhead box O transcription factor 1）活性改变及自噬在甘氨酸介导的细胞保护中的调节作用,阐明甘氨酸对缺氧细胞增殖活性的影响及其作用机制,为进一步揭示甘氨酸的细胞保护特性及其分子机制提供依据。方法:ATP耗竭细胞模型及细胞自噬的测定联合应用无糖培养基和呼吸链抑制剂复制细胞ATP耗竭模型,运用ERK1/2（extracellular signal-regulated kinase）的阻断剂PD98059和AKT的阻断剂LY294002处理细胞,检测各组LDH（Lactate dehydrogenase）释放率及MTT吸光度的变化。将犬肾细胞（Madin-Darby canine kidney, MDCK）分为正常组、ATP耗竭组和Gly（Glycine）保护组,运用Western blot检测各组FoxO1和AMPK（ AMP-activated protein kinase ）的磷酸化活性变化。用脂质体转染的方法将GFP-LC3质粒导入MDCK细胞中,16-24 h后行ATP耗竭及Gly保护处理,分别于2 h后在倒置荧光显微镜下观察细胞内的自噬体,或在2 h、3 h或4 h后收集细胞总蛋白,western blot检测各个时间点LC3-II/LC3-I（即MAP-LC3,Microtubule associated protein light chain 3）。缺氧细胞增殖活性及其信号分子的测定将MDCK细胞置于体积分数为5% CO2和95% N2的有机玻璃调节性密闭容器中,用于复制缺氧模型,分别培养24 h、36 h、48 h、72 h或84 h后,通过MTT实验检测甘氨酸对缺氧性损伤MDCK细胞的保护作用。将MDCK细胞分为正常组、缺氧组和Gly保护组,加药后孵育1 h、2 h或3 h,收集细胞总蛋白,用Western blot检测ERK1/2、p38MAPK和Akt的磷酸化活性。结果:加入ERK和Akt阻断剂PD98059和LY294002以后,Gly保护组的LDH释放率与溶剂对照组相比均有升高,MTT OD值均有降低。单独加入50μM PD98059作用,Gly保护组的LDH释放率为相应ATP耗竭组的30%,100μM为39.4%,加入5μM LY294002作用,Gly保护组的LDH释放率为相应ATP耗竭组的34.8%,10μM为41.5%。而同时加入两种阻断剂联合作用后,低浓度时Gly保护组的LDH释放率为相应ATP耗竭组的64.9%,高浓度为75.3%。当加入100μM PD98059后,Gly对ATP耗竭细胞线粒体酶活性的保护作用消失,但阻止ATP耗竭细胞膜通透性增加的作用仍然存在。加入LY294002后,LDH释放率增高,差异有统计学意义但差值不大,而MTT OD值则明显降低。MDCK细胞处于ATP耗竭状态下15 min, FoxO1的磷酸化水平比正常组降低。Gly处理组与ATP耗竭组相比,FoxO1的磷酸化水平增高。向MDCK细胞转染GFP-LC3质粒,发现细胞胞浆内散布明显的点状荧光颗粒;细胞转染GFP-LC3质粒后再行ATP耗竭,发现细胞内自噬体增多,用甘氨酸处理后可明显减少ATP耗竭所诱生的自噬体。进一步观察细胞不同时段GFP-LC3-II/LC3-I的表达改变,发现ATP耗竭组GFP-LC3-II/LC3-I比值较正常对照组明显增高,Gly处理后使ATP耗竭细胞的GFP-LC3-II/LC3-I比值降低,自噬发生程度下降。细胞ATP耗竭引起AMPK的磷酸化水平增高,Gly处理后则导致AMPK的磷酸化水平降低,AMPK总蛋白各组之间无明显差异。甘氨酸保护组与缺氧组相比,24 h,36 h,48 h时细胞的增殖能力有明显差异,差异具有统计学意义,而在72 h,84 h时无明显差异。缺氧时ERK1/2和Akt的磷酸化活性降低,p38MAPK的磷酸化活性增高,将甘氨酸加入到缺氧细胞中,ERK1/2和Akt又重新被激活,p38MAPK被抑制。结论:Gly能够增强FoxO1的磷酸化活性,从而减缓FoxO1的抑制细胞增殖和诱导细胞死亡的作用。Gly还能抑制ATP耗竭诱导的自噬性细胞死亡过程,其机制与AMPK活性受抑有关。Gly可保护MDCK细胞免于早期缺氧性损伤,该作用可能通过激活ERK和Akt,抑制p38MAPK而实现。

全文目录


中文摘要  4-7
英文摘要  7-10
第一章 前言  10-13
第二章 材料与方法  13-21
  实验材料  13-14
  实验方法  14-21
第三章 结果  21-39
  一 LDH 释放试验及 MTT 试验研究 ERK、Akt 阻断剂对 Gly 保护作用的影响。  21-26
  二 Gly 对核转录因子 FoxO1 活性的影响  26-28
  三 自噬在甘氨酸介导的细胞保护中的调节作用及机制  28-32
  四 Gly 对缺氧 MDCK 细胞增殖活性的影响及机制  32-39
第四章 分析与讨论  39-48
第五章 小结  48-49
缩略词表  49-50
参考文献  50-59
综述  59-71
致谢  71

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学 > 实验药理学
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