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猪TIM1和TIM3基因的特征与功能分析

作　者: 赵为民
导　师: 李奎
学　校: 华中农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 猪 TIM1 TIM3 克隆亚细胞定位 SNP 关联分析启动子
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

CD4~+T细胞遇到抗原激活后至少分化为两类效应细胞Th1和Th2。Th1细胞分泌以IFN-γ为标志的细胞因子并介导细胞内病原体的免疫应答,它的紊乱可导致迟发型超敏反应、自身免疫疾病如实验性自身免疫性脑炎和I型糖尿病。Th2细胞分泌以IL-4为标志的细胞因子并介导细胞外病原体的免疫应答,它的紊乱可导致哮喘和过敏性疾病。Th1细胞和Th2细胞相互之间存在着互相调节,当Th1细胞比例占优时可以调节哮喘以及过敏性疾病,Th2细胞比例占优时可以抑制自身免疫性疾病。研究表明TIM1和TIM3分别是调节Th2细胞和Th1细胞的重要基因,此外TIM1和TIM3基因还存在与哮喘和过敏症等疾病相关的多态位点。因而TIM1和TIM3基因的表达调控和功能对Th1与Th2细胞之间的相对平衡以及机体的免疫力具有重要影响。本研究通过生物信息学和比较基因组学方法克隆了猪TIM1和TIM3基因的完整编码区,利用分子生物学和细胞生物学技术,从核酸序列及细胞两个水平上对其特征进行了研究,主要取得了如下研究结果:(1)通过生物信息学和比较基因组学克隆了猪TIM1基因和TIM3基因的完整CDS区,TIM1和TIM3都位于猪第16号染色体上而且彼此紧密相连。经预测TIM1包括一个1050bp的开放阅读框,编码蛋白349个氨基酸残基,推测其有8个外显子和7个内含子。TIM3包括一个852bp的开放阅读框,编码蛋白284个氨基酸残基,推测其有7个外显子和6个内含子,外显子和内含子之间序列衔接遵循GT-AG规则。(2)组织表达谱显示TIM1 mRNA在正常各个组织中表达均比较低,而TIM3mRNA在各个组织中表达高低不等。TIM1和TIM3 mRNA在脾中表达都相对最高,而在肌肉中几乎都不表达。(3)亚细胞定位结果显示TIM3蛋白定位于细胞膜上。(4)在TIM3基因的第2、第3、第5、第7以及启动子上发现了多个SNP位点,并在第2外显子的一个SNP位点上应用AccI-RFLP方法在温氏群体中进行检测,发现该位点与红细胞计数(RBC)显著相关(P=0.0409),与平均红细胞血红蛋白量(MCH)显著相关(P=0.0294);对于17日龄仔猪,该位点与红细胞计数(RBC)极显著相关(P=0.0089),与红细胞压积(HCT)显著相关(P=0.0168);对于32日龄仔猪,该位点与淋巴细胞(%)(LYM)极显著相关(P=0.0048),与淋巴细胞绝对值(LY)显著相关(P=0.033)。(5)克隆了猪TIM3基因5′侧翼区大约2000bp片段并构建到PGL3-Basic载体中。

全文目录

摘要  8-9
ABSTRACT  9-11
缩略词表(ABBREVIATIONS)  11-12
1 前言  12-20
  1.1 研究问题的由来  12
  1.2 文献综述  12-19
    1.2.1 猪抗病性状的相关候选基因研究  12-13
      1.2.1.1 FUT1基因与抗病性  12
      1.2.1.2 MHC与抗病性  12
      1.2.1.3 IFN基因与抗病性  12-13
      1.2.1.4 Hal和NRAMP1基因与抗病性  13
      1.2.1.5 Mx基因与抗病性  13
    1.2.2 拟分离基因的研究进展  13-19
      1.2.2.1 TIM基因的定位  13-14
      1.2.2.2 TIM基因的结构  14-16
      1.2.2.3 TIM基因的功能  16
      1.2.2.4 TIM1的功能  16-17
      1.2.2.5 TIM3的功能  17-18
      1.2.2.6 TIM2和TIM4的功能  18
      1.2.2.7 TIM基因多态与疾病的关系  18-19
  1.3 本研究的目的和意义  19-20
2 材料与方法  20-32
  2.1 材料  20-24
    2.1.1 DNA样和组织样  20
    2.1.2 载体和菌株  20-21
    2.1.3 主要试剂  21-22
    2.1.4 主要仪器  22
    2.1.5 常规试剂的配置  22-23
    2.1.6 主要分子生物学软件  23-24
    2.1.7 主要数据库  24
  2.2 方法  24-32
    2.2.1 总RNA提取、完整性检测、DNase Ⅰ处理以及cDNA的合成  24-25
      2.2.1.1 采用TRIZOL提取组织样RNA  24
      2.2.1.2 试剂盒提取RNA  24-25
      2.2.1.3 RNA的完整性检测  25
      2.2.1.4 总RNA的DNase-Ⅰ处理及其纯化  25
      2.2.1.5 RNA的反转录  25
    2.2.2 猪TIM1和TIM3基因CDS的克隆、组织表达谱  25-29
      2.2.2.1 引物设计  25-26
      2.2.2.2 PCR扩增条件  26
      2.2.2.3 PCR产物回收、克隆和测序  26-28
      2.2.2.4 猪TIM1和TIM3的组织表达谱  28-29
    2.2.3 猪TIM3蛋白的亚细胞定位  29-30
      2.2.3.1 猪TIM3基因亚细胞定位载体的构建  29
      2.2.3.2 细胞培养以及转染  29-30
    2.2.4 猪TIM3基因SNP鉴定、分型和关联分析  30-31
      2.2.4.1 引物设计  30
      2.2.4.2 SNP检测鉴定  30
      2.2.4.3 PCR-RFLP  30
      2.2.4.4 试验资源猪群性状测定  30-31
      2.2.4.5 数据统计分析  31
    2.2.5 猪TIM3基因5′侧翼区的克隆和报告载体的构建  31-32
3 结果  32-47
  3.1 猪TIM1和TIM3基因的基本特征  32-36
    3.1.1 猪TIM1和TIM3的mRNA序列  32
    3.1.2 TIM1和TIM3基因的系统进化树  32-33
    3.1.3 猪TIM1和TIM3蛋白信号肽的预测图  33-34
    3.1.4 猪TIM1和TIM3蛋白的跨膜预测  34-35
    3.1.5 猪TIM1和TIM3功能域分析  35-36
    3.1.6 部分活性位点预测  36
      3.1.6.1 猪TIM1蛋白部分活性位点预测  36
      3.1.6.2 猪TIM3蛋白部分活性位点预测  36
  3.2 猪TIM1和TIM3的组织表达谱  36-41
    3.2.1 猪TIM1的组织表达谱  36-37
    3.2.2 人TIM1的组织表达情况  37-38
    3.2.3 猪TIM3的组织表达谱  38-40
    3.2.4 人TIM3基因的组织表达情况  40-41
  3.3 猪TIM3蛋白的亚细胞定位  41-42
    3.3.1 空载体pEGFP-N1亚细胞定位  41
    3.3.2 猪TIM3-GFP融合蛋白的亚细胞分布  41-42
  3.4 猪TIM3的SNP检测和关联分析  42-45
    3.4.1 猪TIM3外显子和启动子的多态位点检测结果  42
    3.4.2 关联分析  42-45
  3.5 猪TIM3基因5′侧翼区的序列和报告载体的酶切图谱  45-47
    3.5.1 猪TIM3基因5′侧翼区的序列  45-46
    3.5.2 猪TIM3基因5′侧翼区报告载体的酶切图  46-47
4 讨论  47-50
  4.1 猪TIM1和TIM3的基本特征  47
  4.2 猪TIM1和TIM3基因的组织表达谱分析  47
  4.3 猪TIM3蛋白的亚细胞定位  47-48
  4.4 猪TIM3的多态位点与性状关联分析  48-50
5 小结  50-52
  5.1 本研究获得的主要结果  50
  5.2 本研究的创新点与特色  50
  5.3 本研究的不足之处  50-51
  5.4 下一步研究的思路  51-52
参考文献  52-61
研究生期间发表的论文  61-62
附录一  62-63
致谢  63

猪TIM1和TIM3基因的特征与功能分析

内容摘要

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