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疟疾荧光定量PCR诊断技术的研究

作　者: 江晓玲
导　师: 李明
学　校: 第一军医大学
专　业: 免疫学
关键词: 疟疾间日疟原虫恶性疟原虫 PCR 定量PCR 荧光定量PCR
分类号: R446.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2000年
下　载: 343次
引　用: 2次
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内容摘要

疟疾是广泛流行于热带、亚热带甚至温带边缘的一种重要虫媒传染病，对人类健康造成很大危害，其防治深受国际医学界的重视。快速、有效的疟疾诊断方法，已成为疟疾防治问题的迫切需要；而简便、快速定量检测疟原虫的方法，更因能准确定量检测疟原虫，不仅在研究疟原虫的感染程度与疟疾发生、发展的关系以及抗疟治疗的监控等方面具有深化疟疾防治研究的良好功能，同时也可为新药和疟疾疫苗的研制和评价提供更客观、可信的量化资料。近十年来迅猛发展起聚合酶链式反应（PCR）技术及以其为基础的定量技术，以其快速、简便以及高灵敏度等优点，在疟疾的诊断中受到了广泛的重视，但存在有产物的污染易致假阳性、PCR扩增后期出现“平台效应”而难以准确定量等问题。1995年出现的一种以有探针、可实时定量监测为特征的荧光定量PCR检测方法，因能有效克服上述缺点，而引起了国际医学界的高度重视，在病原体检测中有取代传统PCR的趋势。本研究的目的即是建立两种最常见的疟原虫——恶性疟原虫和间日疟原虫的荧光定量PCR检测方法并对其进行评价，为开发快速、准确定量检测疟原虫的荧光定量PCR检测试剂盒奠定基础。根据两种疟原虫SSUrRNA基因的保守序列，分别设计针对恶性疟原虫和间日疟原虫特异的引物和探针（探针位于上、下游引物之间），并对探针进行荧光标记。采用PCR产物克隆法分别构建恶性疟和间R疟SSUrRNA靶片段重组质粒，用作荧光定量PCR的阳性标准对照，分别进行荧光定量PCR扩增条件的优化和标准曲线的建立。最后以此为基础进行样品检测，通过与常规PCR、镜检结果的比较，对恶性疟原虫和间日疟原虫的荧光定量PCR检测方法作出评价。结果显示，所克隆的恶性疟原虫和间日疟原虫的重组质粒，通过酶切鉴定和对克隆基因的测序鉴定，表明克隆基因的片段大小和基因序列与目的基因完全一致。对荧光定量PCR进行条件忧化的结果为，Mg’”的最佳浓度为。5刀mmol／L，退火延伸最佳温度为55℃。在此条件下，对恶性疟原虫和间日疟原虫的阳性定量梯度模板进行扩增，得到PCR扩增的动力学曲。线图。分析表明，不同起始浓度的模板。在反应后平台期的产物量相。差不大，而如果将检测点定为产物大量生成初期的循环数一循环阈值。 uT值），则发现起始模板浓度的对数值与 CT值之间呈良好的直线才关关系，十关系数分别为 0．998（P＜0二001，恶性疟）和 0．996 …狈．001，间R疟），两种疟原虫的检测阈值均值为100拷贝／ul。进行样品的荧光定量检测时，均设阳性定量标准模板对照和阴性对照。将每份样品检测所得曲线的CT值与CT一模板浓度相关曲线相比较，即得出定性和定量结果。对 127例疟区患者血样的定性结果显示，恶性疟原虫镜检、常规PCR、荧光定量PCR检出的阳性率分别为33．l0、39．4o，40．2O：问H疟原虫镜检、常规Pm、荧光定量叮R阳性率分别为36二％、忙．5％和忙厂％。统计学分析表明三种方法两两之间有一致性h．001），而荧光定量PCR与镜检法之间存在差别 …狈．01 人与常规PCR法无显著性差异巾川．05）。对镜检阳性血样的定量检测结果表明，定量检测的拷贝数和镜检感染率之间具有直线相关关系，相关系数分另为0．961（p（0．001，恶性疟）和0．95 9（狈．001，间日疟＼另外，荧光定量mR还显示出较高的灵敏度和特异度。恶性疟检测的灵敏度为 IXIO’％（原虫感染率，每 100个红 3细胞中的原虫数），间R疟为1．26XIO’％（原虫感染率），此浓度下的血样DNA模板用荧光定量PCR扩增仍可出现典型‘S”形曲线，而镜检法在原虫率为4X10－’％时己很难得出阳性结果，而对非疟区m份正常人血样的检测结果均为阴性。上述结果显示，荧光定量PCR具有较高的灵敏度和特异度，并在一定程度上优于镜检法和常规PCR法。研究表明，我们已在国内外首次建立了恶性疟原虫和间日疟原虫荧光定量PCR检测法，小样木血样的检测反映了此法的准确性和优越性。为研制疟原虫荧光定量PCR检测试剂盒奠定了基础，也为更深入的疟疾防治研究提供了一条可行途径。

全文目录

中英对照  5-6
中文摘要  6-9
英文摘要（ABSTRACT）  9-12
前言  12-15
材料和方法  15-23
  一、材料  15-16
  二、实验方法  16-23
    （一）恶性疟原虫荧光定量PCR检测方法的建立  16-21
      1．引物及探针的设计及合成  16-17
      2．靶基因的扩增与纯化  17-18
        2．1 模板DNA的制备  17
        2．2 常规PCR扩增  17
        2．3 检测  17-18
        2．4 靶基因的纯化  18
      3． PCR扩增产物的克隆  18-19
        3．1 重组质粒的构建  18-19
        3．2 重组质粒的筛选  19
      4．荧光定量PCR反应条件的优化和标准曲线的建立  19-20
        4．1 阳性定量标准模板的建立  19
        4．2 荧光定量PCR反应条件的优化及标准曲线的建立  19-20
          Mg~（2+）浓度的优化  20
          退火温度的优化  20
          荧光定量标准曲线的建立  20
          模板提取方法的选择  20
      5．样品的检测结果  20-21
        5．1 与镜检、常规PCR检测法比较  20-21
        5．2 荧光定量PCR方法的评价  21
          敏感度  21
          特异度  21
          仪器的稳定性  21
          操作的稳定性  21
          统计学处理  21
    （二）间日疟原虫荧光定量PCR检测方法的建立  21-23
      1．血样采集及模板DNA的制备  22
      2．引物及探针的设计与合成  22
      3．靶基因的扩增与纯化  22
      4． PCR产物的克隆  22
      5．阳性定量标准曲线的建立  22
      6．样品的检测  22-23
结果  23-41
  一、恶性疟原虫荧光定量PCR方法的建立  23-35
    1． PCR扩增产物的鉴定  23
    2．重组质粒的筛选  23-27
    3．荧光定量PCR反应条件的优化及标准曲线的建立  27-30
      Mg~（2+）浓度的优化  27-28
      退火温度的优化  28-30
    4．样品的检测及荧光定量PCR检测方法的评价  30-35
      4．1 模板提取方法的选择  30
      4．2 样品的检测  30-35
        4．2．1 镜检结果  30-31
        4．2．2 常规PCR检测结果  31
        4．2．3 FQ-PCR检测结果及评价  31-35
  二、间日疟原虫荧光定量PCR检测方法的建立  35-41
    1．常规PCR扩增产物的鉴定  35
    2．重组质粒的筛选  35-37
    3．定量标准曲线的建立  37-38
    4．样品检测结果及评价  38-41
讨论  41-49
参考文献  49-48
结论  48-53
致谢  53-54
综述  54-58

疟疾荧光定量PCR诊断技术的研究

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