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联苯降解菌BP3三个2，3-二羟基联苯1，2-双加氧酶基因的表达及酶学特性研究

作　者: 高原
导　师: 李顺鹏；洪青
学　校: 南京农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 联苯 微生物降解 2，3-二羟基联苯1，2-双加氧酶基因 表达 酶学特性
分类号: X172
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


联苯的氯代衍生物多氯联苯(PCBs)是广泛应用的重要工业原料。大量研究表明多氯联苯对人类有致癌作用。多氯联苯的微生物降解一直是环境微生物研究领域的热点之一。多氯联苯的微生物好氧降解是通过联苯代谢途径进行的。2,3-二羟基联苯(2,3-DHBP)的开环是该途径中的一步重要反应,它由2,3-二羟基联苯1,2-双加氧酶催化。前期研究分离到一株联苯降解菌Achromobacter sp. BP3。通过构建其基因组文库,筛选到三个含有2,3-二羟基联苯1,2-双加氧酶基因的阳性克隆,它们带有的重组质粒分别为p118-2、p118-3和p118-5,对其中的外源片段进行测序和分析后,推测了三个2,3-二羟基联苯1,2-双加氧酶基因(bphC、bphC2及xylE)。本研究将三个基因分别构建到表达载体pET29a上,在E. coli BL21(DE3)中进行了功能表达,获得C-末端含有六个寡聚组氨酸的目的蛋白,利用Ni2+亲和层析法纯化,并研究其酶学特性。酶学特性研究结果显示：1.BphC、BphC2和XylE的最适反应温度分别为30℃、30℃和50℃；2. BphC、BphC2和XylE的最适反应pH值分别为8.0、9.0和9.0；3.在1 mmol/L的浓度下,Cu2+和Co2+对三个酶的活性均有抑制作用,但对BphC的抑制最强烈(抑制率大于90%),Mg2+对BphC酶活性基本没有影响,对BphC2和XylE有抑制作用；Fe2+能促进BphC2和XylE酶活性,表明BphC2和XylE是Fe2+依赖型的双加氧酶；4. BphC和BphC2对双环底物2,3-DHBP的亲和性更高；而XylE的亲和性则偏向单环底物。本研究还初步研究了bphC、bphC2及xylE在菌株BP3中的表达情况,结果显示,bphC为组成型表达,bphC2可被联苯诱导,而xylE在联苯和甲苯诱导下均可表达。

全文目录


摘要  6-7ABSTRACT  7-9符号与缩略语说明  9-10前言  10-11文献综述  11-21  一、联苯与多氯联苯的微生物降解  11-16    1. 联苯的概述  11    2. 多氯联苯的概述  11-12    3. 降解途径  12-16      3.1 厌氧降解途径  12      3.2 好氧降解途径  12-13      3.3 降解相关基因组织结构  13-16  二、2,3-二羟基联苯1,2-双加氧酶的研究进展  16-21    1. 双加氧酶概述  16    2. 间位双加氧酶的分类  16-18    3. 2,3-二羟联苯双加氧酶的催化机制  18-19    4. 研究意义  19-21实验部分  21-53  第一章 三个2,3-二羟基联苯1,2-双加氧酶基因的克隆及表达  21-31    1. 材料与方法  21-26      1.1 培养基与试剂  21      1.2 菌株与质粒  21-22      1.3 菌体基因组DNA的提取  22-23      1.4. 一步法感受态细胞的制备与转化  23      1.5 质粒DNA的小量提取  23      1.6 2,3-DHBP双加氧酶基因的PCR扩增及及高效表达载体的构建  23-25      1.7 六聚组氨酸标记的2,3-DHBD的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析  25-26    2. 结果与分析  26-30      2.1 菌株BP3和阳性克隆的功能验证  26-27      2.2 2,3-DHBD基因的扩增及重组表达载体的构建  27-29      2.3 六聚组氨酸标记的2,3-DHBD在E coli BL21中的表达及SDS-PAGE分析  29-30    3. 小结  30-31  第二章 三个2,3-二羟基联苯1,2-双加氧酶的纯化及酶学特性研究  31-45    1. 材料与方法  31-35      1.1 培养基与试剂  31      1.2 菌株与质粒  31      1.3 2,3-DHBD的Ni~(2+)亲和层析纯化  31-33      1.4 酶活力检测  33-34      1.5 温度对2,3-DHBD的影响  34      1.6 pH对2,3-DHBD的影响  34      1.7 金属离子对2,3-DHBD的影响  34-35    2. 结果与分析  35-43      2.1 2.3- DHBD的纯化及SDS-PAGE分析  35-36      2.2 2,3-DHBD的反应进程曲线  36-37      2.3 温度对2,3-DHBD的影响  37-39      2.4 pH对2,3-DHBD的影响  39-41      2.5 金属离子对酶活性的影响  41-42      2.6 2,3-DHBD对不同底物的动力学常数  42-43    3. 小结  43-45  第三章 三个2,3-二羟基联苯1,2-双加氧酶基因在BP3中表达调控的初步研究  45-53    1. 材料与方法  45-47      1.1 培养基与试剂  45      1.2 菌株  45-46      1.3 菌体样品的制备  46      1.4 RNA的提取  46-47      1.5 cDNA的制备  47      1.6 普通PCR扩增目的片段  47    2. 结果与分析  47-52      2.1 RNA的提取及质量检测  47-48      2.2 菌株BP3中bphC、bphC2及xylE的诱导转录分析  48-52    3. 小结  52-53全文总结  53-55参考文献  55-63附录一 实验用培养基及分子生物学试剂  63-65附录二 相关基因序列  65-67附录三 攻读硕士学位期间发表或已录用的论文  67-69致谢  69

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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 环境科学基础理论 > 环境生物学 > 环境微生物学
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