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草鱼肠道抗菌肽分离纯化及部分理化性质的研究

作　者: 黄平
导　师: 章怀云
学　校: 中南林业科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 肠道抗菌肽反相高效液相色谱抗菌作用草鱼
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

抗菌肽是鱼体天然免疫体系中的重要组成部分,它属于非特异性免疫,能够迅速地在体内合成并扩散,抵御病原微生物侵害,其反应速度是特异性免疫系统所不可比拟的,因此在鱼害疾病的防治,鱼类品种的改良等方面,抗菌肽能够开辟出一条新的研究途径。本试验应用SephadexLH-20凝胶层析,RP-HPLC等分离技术对草鱼肠道抗菌肽进行分离纯化并对其基本的理化性质进行了研究。1.草鱼肠道抗菌肽的分离与纯化本实验将新鲜草鱼肠道经充分破碎后,再经超声波处理、5%乙酸浸提,冻干,SephadexLH-20凝胶过滤层析,收集样品冷冻真空干燥后,以0.1 mol/L乙酸铵溶液作为空白对照,作抑菌活性检测,其中具有抗菌活性的成分利用高效液相色谱分析,收集各组分冻干,并用牛津杯扩散法及纸片扩散法检测各组分的抗菌活性。通过改变反相高效液相色谱洗脱条件对草鱼肠道抗菌肽进行进一步分离,得到纯度更高的抗菌肽样品,纯化后抗菌肽冷冻真空干燥,4℃,保存。2.草鱼肠道抗菌肽抗菌活性鉴定及理化性质的研究采用纸片扩散实验检测草鱼肠道抗菌肽对致病性大肠杆菌(pathogenic Escherichia coli)、致病性金黄色葡萄球菌(pathogenic Staphyloccocus aureus)、鱼致病性沙门氏菌(Salmonella)、鱼致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas Hydrophila)、鱼害粘球菌(Myxococcus piscicola)、巴氏杆菌(Pasteurella)、链球菌(Streptococcus)等7株细菌的抗菌作用。结果表明,草鱼肠道抗菌肽对金黄色葡萄球菌作用一般外,对以上其他6株菌株均有较强的抑制或杀灭作用。将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌与草鱼肠道抗菌肽在37℃下作用30 min,扫描电镜下观察草鱼肠道抗菌肽对这三株细菌形态结构的影响。结果显示,草鱼肠道抗菌肽作用于细菌细胞膜,导致细菌表面出现囊泡状或不规则突起样结构,细菌严重变形、扭曲、表面变得粗糙、皱缩、胞膜破裂、内容物外泄而死。草鱼肠道抗菌肽分别用不同的温度处理30 min之后,检测其抗菌活性。实验结果表明,经过高温处理的草鱼肠道抗菌肽样品的抗菌活性基本没有发生改变,因此认为该抗菌肽具有良好的热稳定性。利用胰蛋白酶对草鱼肠道抗菌肽进行酶切16h,然后通过RP-HPLC系统对酶切后产物进行回收,并做抗菌活性的检测。结果显示,在经过胰蛋白酶酶切后的抗菌肽样品在RP-HPLC中的保留时间基本未发生改变,同时,回收样品的抗菌实验中,样品依然具有很好的抗菌活性,我们可以认为该抗菌肽物质在蛋白酶作用下,一级结构没有发生变化,可能是由于该抗菌肽缺乏胰蛋白酶作用位点或者该类抗菌肽具有耐蛋白酶酶切特性。3.草鱼肠道抗菌肽的氨基酸序列分析通过凝胶层析和反相液相色谱纯化得到的草鱼肠道抗菌肽样品进行MALDI-TOF-MS分析,样品分子量约为2762 Da。蛋白质N-端氨基酸序列分析,在预实验的过程中,发现N-端氨基酸序列分析过程中,出现多次Asn、Ser、Thr等信号,推断在该抗菌肽氨基酸序列中存在Asn、Ser、Thr等蛋白质糖基化位点存在。利用去糖基化试剂盒处理纯化得到的抗菌肽样品进行去糖基化处理后回收目的肽,冷冻真空干燥后,进行蛋白质N-端氨基酸序列分析,得到一条含有30个氨基酸的N-端序列VKGLVGFAGRRGPPGPRGPVGPAGAKGHQG,通过APD数据库对该序列进行分析和比对,发现该抗菌肽N-端氨基酸序列与其相似度较高的5种抗菌肽分别是意大利蜂Apis mellifera L中发现的ABAECIN,相似度为40.54%,从乳酸菌Lactobacillus salivarius DPC6005、Lactobacillus salivarius subsp. salivarius UCC118中纯化得到的Salivaricin P、ABP-118,相似度为36.95%,从白纹伊蚊mosquito, Aedes albopictus中发现的Cecropin C,相似度为36.84%；从猪唾液腺中分离纯化到porcine proline-rich antifungal peptide SP-B,相似度为36.66%。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
1 绪论  11-24
  1.1 抗菌肽的生物学活性  11-14
    1.1.1 抗菌肽的抗细菌作用  11-12
    1.1.2 抗菌肽对抗真菌作用  12
    1.1.3 抗菌肽的抑制原虫的作用  12-13
    1.1.4 抗菌肽的抗病毒作用  13
    1.1.5 抗菌肽抑制癌细胞作用  13-14
    1.1.6 抗菌肽的溶血活性  14
    1.1.7 抗菌肽的抑制精子活性  14
  1.2 抗菌肽的作用机制  14-16
    1.2.1 "桶-桶板(Barrel-stave)"模型  14-16
    1.2.2 "地毯(Carpet)结构"模型  16
    1.2.3 其他作用机制  16
  1.3 抗菌肽的工业应用  16-18
    1.3.1 抗菌肽食品工业中的应用  16
    1.3.2 抗菌肽饲料及养殖业的应用  16-17
    1.3.3 抗菌肽日用化工中的应用  17
    1.3.4 抗菌肽医药工业中的应用  17-18
  1.4 鱼类抗菌肽的分类及生化特点  18-20
    1.4.1 鱼类抗菌肽的组成及分类  18
    1.4.2 鱼类抗菌肽结构及生物学活性  18-20
  1.5 鱼类抗菌肽基因工程研究进展  20-22
    1.5.1 国内研究进展  20-21
    1.5.2 国外研究进展  21-22
  1.6 本论文立题依据、研究目的意义及技术路线  22-24
2 草鱼肠道抗菌肽的分离与纯化  24-33
  2.1 材料与试剂  24-25
    2.1.1 实验材料  24-25
    2.1.2 菌种  25
    2.1.3 主要仪器  25
    2.1.4 主要试剂  25
  2.2 实验方法  25-28
    2.2.1 草鱼肠道抗菌肽粗样品制备  25-26
    2.2.2 SephadexLH-20凝胶过滤层析  26-27
    2.2.3 抗菌活性的检测  27
    2.2.4 草鱼肠道抗菌肽RP-HPLC纯化  27-28
  2.3 实验结果  28-31
    2.3.1 草鱼肠道抗菌肽SephadexLH-20凝胶层析分离纯化  28-29
    2.3.2 草鱼肠道抗菌肽凝胶层析样品活性检测  29
    2.3.3 草鱼肠道抗菌肽凝胶层析样品RP-HPLC分析  29-30
    2.3.4 草鱼肠道组织抗菌肽RP-HPLC分析收集成分活性检测  30
    2.3.5 草鱼肠道抗菌肽RP-HPLC收集样品第二次分离  30-31
  2.4 讨论  31-33
3 草鱼肠道抗菌肽抗菌活性鉴定及理化性质的研究  33-42
  3.1 材料与试剂  33-34
    3.1.1 实验材料  33
    3.1.2 主要试剂  33-34
  3.2 实验方法  34-35
    3.2.1 细菌抑菌实验  34
    3.2.2 抗菌肽处理对大肠杆菌形态结构变化影响的电镜观察  34
    3.2.3 蛋白酶对抗菌肽作用的影响  34-35
    3.2.4 不同温度对抗菌肽活性的影响  35
  3.3 实验结果  35-40
    3.3.1 抗菌肽抗菌活性鉴定  35-36
    3.3.2 抗菌肽处理对细菌形态结构变化影响  36-38
    3.3.3 蛋白酶对抗菌肽作用的影响  38-39
    3.3.4 不同温度对抗菌肽活性的影响  39-40
  3.4 讨论  40-42
4 草鱼肠道抗菌肽氨基酸序列分析  42-49
  4.1 材料与试剂  43
    4.1.1 实验材料  43
    4.1.2 主要仪器  43
    4.1.3 主要试剂  43
  4.2 实验方法  43-44
    4.2.1 抗菌肽样品准备  43
    4.2.2 抗菌肽样品去糖基化处理  43-44
    4.2.3 抗菌肽样品回收  44
    4.2.4 抗菌肽样品质谱(MALDI-TOF-MS)分析  44
    4.2.5 抗菌肽样品N-端序列分析  44
  4.3 实验结果  44-47
    4.3.1 草鱼肠道抗菌肽样品酶切后RP-HPLC回收  44-45
    4.3.2 回收样品质谱MALDI-TOF-MS分析  45-46
    4.3.3 草鱼肠道抗菌肽样品N-端序列分析  46-47
  4.4 讨论  47-49
5 结论、创新点及展望  49-51
  5.1 结论  49-50
  5.2 创新点  50
  5.3 展望  50-51
参考文献  51-58
附录  58-59
致谢  59

草鱼肠道抗菌肽分离纯化及部分理化性质的研究

内容摘要

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