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亚洲型猪囊尾蚴排泄分泌抗原M13h基因的克隆与表达

作　者: 赵光辉
导　师: 宁长申；张改平；张龙现
学　校: 河南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪囊尾蚴 coxI M13h 原核表达 真核表达
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 28次
引　用: 2次
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内容摘要


猪囊尾蚴病是一种重要的人畜共患寄生虫病,不但引起猪肉品质下降,而且给人类健康造成重大危害。因此,猪囊尾蚴病的免疫诊断和免疫预防引起了国内外学者的关注。在本研究中:(1)利用总RNA提取技术、反转录技术和PCR技术从河南部分地域的猪囊尾蚴中获得10个分离株的coxI部分基因序列,其长度为344bp;将其克隆入pMD19-T并测序;分别用Clustal X 1.81程序对序列进行比对,然后用PAUP 4.0程序中的MP法和NJ法绘制种系发育树,并用PUZZLE 5.2程序构建最大似然树;同时利用WDANSIST 2.5程序和DNAstar5.0中的Megalign程序进行同源性分析。(2)利用RT-PCR.技术克隆了猪囊尾蚴的排泄分泌抗原M13h基因,用Megalign和Protean软件对序列进行分析,利用Anthprot 5.0和SignalPserver进行信号肽序列预测,然后利用Blast程序进行同源搜索,用Clustal X和WDNASIST软件进行比对分析,用Paup 4.0程序中的MP法和NJ法绘制种系发育树,并用PUZZLE 5.2程序构建最大似然树。(3)然后将M13h基因克隆入pET43a和pcDNA3.0中构建重组表达载体pET43M13h和pc3M13h;将pET43M13h转化BL21(DE3)宿主菌进行原核表达,利用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物;将pc3M13h转染COS-7细胞进行真核表达,利用双抗体夹心ELISA法和免疫细胞化学检测表达产物。结果表明,10个河南猪囊尾蚴分离株的coxI部分基因序列完全一致,属于猪带绦虫亚洲基因型;猪囊尾蚴coxI部分基因可有效区分出Asian和American/African两种基因型,并可用于带科绦虫不同种的鉴别诊断,有望成为一种鉴别基因用于带科绦虫病及其囊尾蚴病的PCR鉴别诊断中;成功克隆了猪囊尾蚴排泄分泌抗原M13h的基因,并证明该基因地域差异性不显著,有可能位于六钩蚴阶段且是特异性抗原,因此,该蛋白有望成为囊虫病的诊断抗原;成功构建了M13h基因原核表达载体pETM13h,并在大肠杆菌中被表达,表达的蛋白以包涵体形式存在,能够与兔抗囊虫多抗血清特异性反应;成功构建了M13h基因真核表达载体pc3M13h,并在COS-7细胞中分泌表达,通过检测发现pc3M13h在COS-7细胞培养上清和细胞内表达,并且表达产物与兔抗囊虫多抗血清或IgG反应,说明该表达蛋白具有免疫反应性。

全文目录


致谢  4-7
缩略词表  7-10
摘要  10-11
文献综述  11-26
  一 我国囊尾蚴病流行病学研究进展  11-16
    1.病原学  11
    2.感染状况  11-13
    3.感染来源  13
    4.猪囊尾蚴病与人囊尾蚴病的关系  13-14
    5.职业、年龄、性别和民族  14
    6.囊尾蚴病流行的新特点  14-15
    7.小结  15-16
  二 猪囊尾蚴循环抗原和排泄分泌抗原研究进展  16-21
    1.循环抗原和排泄分泌抗原的成份及特异性  16-17
    2.循环抗原和排泄分泌抗原在免疫学上的应用  17-21
  三 脑囊尾蚴病抗体检测方法研究进展  21-26
    1.小扁豆凝集素糖蛋白抗原及其在脑囊尾蚴病抗体检测中的应用  21-23
    2.10kDa抗原及其在脑囊尾蚴病抗体检测中的应用  23
    3.排泄分泌抗原及其在脑囊尾蚴病抗体检测中的应用  23-24
    4.异源抗原及其在脑囊尾蚴病抗体检测中的应用  24
    5.免疫胶体金技术在脑囊尾蚴病抗体检测中的应用  24-25
    6.小结与展望  25-26
实验一 基于coxI基因对猪囊尾蚴河南分离株种系发育关系的研究  26-35
  1.材料和方法  26-28
  2.结果  28-33
  3.小结与讨论  33-35
实验二 猪囊尾蚴排泄分泌抗原M13h的克隆及其序列分析  35-45
  1.材料与方法  35-38
  2.结果  38-43
  3.小结与讨论  43-45
实验三 猪囊尾蚴排泄分泌抗原M13h在大肠杆菌细胞中的原核表达  45-54
  1.材料与方法  45-49
  2.结果  49-52
  3.小结与讨论  52-54
实验四 猪囊尾蚴排泄分泌抗原M13h在COS-7细胞中的真核表达  54-60
  1.材料与方法  54-57
  2.结果  57-59
  3.小结与讨论  59-60
结论  60-61
参考文献  61-69
Abstract  69-71
硕士期间发表论文清单  71

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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