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猪链球菌2型MRP、EF和GroEL免疫保护力的研究

作　者: 葛君
导　师: 金梅林
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白胞外因子亲和层析免疫保护力热休克蛋白促炎因子
分类号: S852.611
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

猪链球菌2型（Streptococcus Suis 2,SS2）可以引起猪脑膜炎、关节炎、败血症、浆膜炎、心内膜炎、多发性关节炎等,同时对畜牧业从业人员带来了严重的威胁,可以导致人的脑膜炎及中毒性休克综合症等严重疾病。（一）猪链球菌2型MRP、EF和SLY的纯化目前对猪链球菌2型的研究主要集中在毒力相关因子上,发现和鉴定新的毒力相关因子仍是国内外研究的重点。猪链球菌2型致病机理尚不太清楚,迄今为止,公认的毒力相关因子有荚膜多糖（CPS）、溶菌酶释放蛋白（MRP）、胞外因子（EF）、溶血素（SLY）和粘附素等,但目前对MRP和EF的研究主要仍集中在流行病学上,其他方面的研究很少涉及。一个可能的原因是获得完整的MRP和EF蛋白片段具有一定的难度,故限制了此2种毒力相关因子在其功能和致病机制方面的研究。本次试验利用表达载体pET-28a和pGEX-KG将MRP全长基因分为3段进行分段克隆表达及蛋白纯化;同时利用硫酸铵分级沉淀的方法提取了EF蛋白。用纯化后的MRP、EF和SLY蛋白免疫Babl/c小鼠,以小鼠5倍LD₅₀剂量的猪链球菌2型强毒株攻击后,评价了猪链球菌2型3个主要毒力相关因子的相对保护率（relativepercent survival,RPS）情况,同时对MRP的有效抗原成分进行了比较和分析。本次试验在带有His标签和GST标签重组蛋白的亲和层析纯化和硫酸铵分级沉淀的纯化工艺上进行了改进和探索。（二）猪链球菌2型的热休克蛋白热休克蛋白（Heat Shock Proteins,HSPs）是从细菌到哺乳动物中广泛存在的一类热应急蛋白质,具有高度保守的氨基酸序列。热休克蛋白在正常细胞中呈基础性表达,维持细胞的基本形态和功能;当细胞处于应激环境时,热休克蛋白大量表达,参与细胞的损伤和修复,发挥应激保护作用,热休克蛋白具有分子伴侣活性。按照分子量大小将热休克蛋白共分为五类,分别为Hsp100,Hsp90,Hsp70,Hsp60以及小分子热休克蛋白（small Heat Shock Proteins,sHSPs）。真核生物的热休克蛋白已经成为目前生物学领域研究的热点,但目前对细菌热休克蛋白的研究很少。本次试验克隆表达了猪链球菌2型四川分离株SC-19的5个热休克蛋白基因包括GroEL、Dnak、GrpE、Hsp33和GroEs;选取了GroEL和Dnak为研究对象进行了小鼠免疫保护力的研究,用ELISA方法监测了免疫后7周内小鼠的抗体增长情况,同时检测了免疫后小鼠产生抗体亚类的情况:最后以Babl/c小鼠为实验动物模型研究了GroEL引起小鼠脾细胞促炎因子（IL-10、IL-6、IF-N和IL-4,）的在mRNA水平的变化。试验结果表明:Dnak和GroEL能在初次免疫后两周后产生较高滴度的抗体,GroEL能使脾细胞中IL-10在mRNA水平上显著上调表达。

全文目录

缩略语表(按字母顺序排列)  6-7
摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
第1章文献综述  11-20
  1.1 猪链球菌  11-16
    1.1.1 猪链球菌病  11
    1.1.2 病原学  11-12
    1.1.3 血清型  12
    1.1.4 流行病学  12-13
    1.1.5 毒力(相关)因子  13-15
    1.1.6 致病机理  15-16
  1.2 热休克蛋白  16-20
    1.2.1 热休克蛋白概论  16
    1.2.2 热休克蛋白的分子生物学  16-17
    1.2.3 热休克蛋白的的重要分子生物学功能  17-20
第2章猪链球菌2型MRP、EF和SLY的纯化及小鼠免疫保护力的研究  20-39
  2.1 前言  20-21
    2.1.1 溶菌酶释放蛋白(MRP)和细胞外因子(EF)  20
    2.1.2 溶血素(SLY)  20-21
  2.2 材料与方法  21-30
    2.2.1 菌株和质粒  21
    2.2.2 试剂及仪器  21
    2.2.3 主要缓冲液  21-22
    2.2.4 MRP蛋白的纯化  22-28
    2.2.5 利用硫酸铵分级沉淀方法提取EF蛋白  28
    2.2.6 SLY蛋白的纯化及溶血活性的鉴定  28-29
    2.2.7 FPLC系统在纯化带有His标签蛋白的两种洗脱方法的比较  29
    2.2.8 三种毒力相关蛋白的小鼠免疫保护力试验  29-30
  2.3 结果  30-36
    2.3.1 MRP基因的克隆及重组MRP质粒的双酶切鉴定  30-31
    2.3.2 重组蛋白MRP各段的表达、纯化和免疫印迹试验  31-32
    2.3.3 MRP蛋白序列分析结果  32-33
    2.3.4 硫酸铵分级沉淀提纯EF蛋白和免疫印迹分析  33
    2.3.5 SLY蛋白的纯化及溶血活性鉴定  33-34
    2.3.6 亲和层析法纯化带有His标签蛋白的两种洗脱纯化方法的比较  34-35
    2.3.7 MRP-A、EF和SLY的兔多克隆抗体的制备  35
    2.3.8 小鼠免疫保护力试验  35-36
  2.4 讨论  36-39
    2.4.1 MRP基因的克隆表达  36-37
    2.4.2 带有HIS标签蛋白的亲和层析纯化  37
    2.4.3 带有GST标签蛋白亲和层析纯化  37-38
    2.4.4 硫酸铵分级沉淀提取EF蛋白  38
    2.4.5 MRP、EF和SLY小鼠保护力试验  38-39
第3章热休克蛋白GROEL在免疫学特性的初步研究  39-54
  3.1 前言  39-40
  3.2 材料与方法  40-45
    3.2.1 菌株与质粒  40
    3.2.2 试剂及仪器  40
    3.2.3 主要缓冲液  40-41
    3.2.4 热休克蛋白基因的原核表达  41-42
    3.2.5 蛋白的纯化  42
    3.2.6 免疫原性的鉴定  42
    3.2.7 蛋白序列分析  42
    3.2.8 GroEL和Dnak小鼠保护力的研究  42-43
    3.2.9 GroEL引起小鼠脾细胞促炎症因子的变化  43-45
  3.3 结果  45-49
    3.3.1 热休克蛋白的纯化  45
    3.3.2 免疫反应性  45-46
    3.3.3 热休克蛋白蛋白基因序列分析  46-47
    3.3.4 GroEL和Dnak小鼠免疫保护力研究  47
    3.3.5 免疫小鼠抗体的增长  47-48
    3.3.6 IgG1和IgG2a比值  48
    3.3.7 小鼠脾细胞促炎症因子的变化情况  48-49
  3.4 讨论  49-54
    3.4.1 四川分离株SC-19的GroEL(hsp60)基因  49-51
    3.4.2 GroEL和Dnak蛋白的免疫保护力研究  51
    3.4.3 小鼠脾细胞促炎症因子的变化情况  51-52
    3.4.4 细菌热休克蛋白成为有效的分子佐剂的展望  52-54
第4章全文小结  54-55
参考文献  55-64
致谢  64-65
附录  65-67

猪链球菌2型MRP、EF和GroEL免疫保护力的研究

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