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JC病毒VP2蛋白的抗原抗体制备及核定位信号与入核转运受体的鉴定

作　者: 王殿丽
导　师: 林原
学　校: 大连医科大学
专　业: 药理学
关键词: VP2蛋白表达纯化多克隆抗体核定位信号入核转运受体
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

目的:JC病毒属于人类多瘤病毒属,是一种重要的机会感染性疾病病原体。JC病毒广泛分布于人群中,有80﹪的成人血清学检测为阳性[1]。当免疫力低下时,JC病毒会引发多灶性脑白质病(PML)[2]。然而,JC病毒的临床检测,以及它的包膜蛋白VP2入核的机制和入核转运受体并不清楚。本研究拟通过原核表达、抗体制备、核定位信号鉴定和入核转运受体的鉴定几个方面初步阐释JC病毒的小包膜蛋白VP2基因在PML发生发展过程中的生物学功能。方法:(1)构建原核表达载体pET-32a(+)-VP2,转化BL21宿主菌后经IPTG诱导,获得了带有组氨酸标签的重组融合蛋白的优化表达。(2)利用Ni+亲和柱纯化表达蛋白并免疫BALB /c小白鼠,获得抗VP2多克隆抗体。以纯化VP2为抗原,利用Western blot和ELISA法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。(3)构建重组绿色荧光表达载体pEGFP-C1-VP2,转染7402细胞,24hr后观察各截短体的亚细胞定位情况。(4)表达纯化pGEX-2T-importin(importinα1、3、5、7和imporinβ)的GST融合蛋白。(5)通过GST-pull down方法,寻找并确定VP2的入核转运受体。结果:(1)通过PCR方法从病人的脑脊液中获得VP2的目的片段,并成功构建了pET-32a(+)-VP2原核表达载体。pET-32a(+)-VP2原核表达载体在IPTG的诱导作用下,成功表达融合蛋白通过Ni+亲和层析法获得了融合蛋白纯品。(2)用纯化的VP2融合蛋白免疫BALB/c小鼠,成功制备了高效价,高特异性的鼠抗VP2多克隆抗体。通过ELISA法表明多克隆抗体效价>1:160,000, Western blot检测证明多克隆抗体的特异性良好。(3)通过PCR方法获得了VP2截短体的目的片段,成功构建了VP2各截短体的绿色荧光表达载体;将构建好的VP2各截短体绿色荧光表达载体转染7402人肝癌细胞,通过各截短体的亚细胞定位分析出了VP2蛋白的核定位信号为946-972段。(4)成功表达纯化了五个pGEX-2Timportin融合蛋白。(5)通过GST-pull down实验,分析发现VP2能够与入核转运受体蛋白importinα1、importinα3结合,从而被转运入细胞核,发挥它的生理和生化作用。结论:1.我们成功构建了pET-32a(+)- Vp2原核表达载体,在IPTG的诱导下,成功表达纯化了VP2融合蛋白。这就为抗体的制备以及研究VP2蛋白与其它蛋白的相互作用做了物质上的准备。2.将VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,制备了高效价、高特异性的鼠抗VP2多克隆抗体。这对于VP2抗原的检测,以及免疫组化奠定了基础。3.成功的鉴定出VP2的核定位信号,通过构建四个pEGFP-C1-Vp2绿色荧光载体,脂质体转染7402细胞株,在荧光显微镜下观察pEGFP-C1-Vp2各截短体的亚细胞定位。这是第一次鉴定出VP2的核定位信号,为进一步的研究提供了信息。4.通过GST-pull down方法,我们成功的鉴定出VP2的入核转运受体为importinα1、importinα3。初步阐明了VP2入核过程中参与的入核转运受体。

全文目录

一、正文  5-35
  （一）中文摘要  5-7
  （二）英文摘要  7-10
  （三）前言  10-11
  （四）第一章 JC 病毒VP2 重组蛋白的表达及多克隆抗体的制备  11-21
    材料与方法  11-15
    结果  15-20
    讨论  20-21
  （五）第二章 VP2 核定位信号与入核转运受体的的鉴定  21-32
    第一节 VP2 蛋白核定位信号的鉴定  21-27
      材料与方法  21-23
      结果  23-26
      讨论  26-27
    第二节 VP2 蛋白核定位受体的鉴定  27-32
      材料与方法  27-28
      结果  28-31
      讨论  31-32
  （六）结论  32-33
  （七）参考文献  33-35
二、文献综述  35-43
  （一）综述  35-41
  （二）参考文献  41-43
三、致谢  43-44

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