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目的:弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury, DAI)是指在头部遭受直线加速性或(和)旋转性暴力打击时,脑组织由于加速运动而产生剪切、伸展和压缩应力,导致脑白质广泛发生以神经轴索损伤为特征的一系列病理生理变化。意识障碍是其典型的表现,临床诊断较困难,预后多差。近年来研究发现,弥漫性轴索损伤造成外伤后的脑功能障碍不仅是由于最初的机械外力对组织的剪切、积压等造成的,更是由于损伤后数小时甚至数天中发生的复杂的“二次打击”造成的。以往的研究主要集中在损伤后神经元的变化,近年有研究发现外伤性脑损伤(traumic brain injury, TBI)后中枢神经系统中的星形胶质细胞和小胶质细胞增生,且随时间的变化而变化。小胶质细胞是中枢神经系统的免疫效应细胞,在中枢神经系统的免疫应答中发挥关键性作用。小胶质细胞也是一种可塑性细胞,不仅能释放神经生长因子,也能释放神经毒因子,其保护作用和损伤神经元的效应依赖于周围环境及活化因子的变化。有实验表明,小胶质细胞是第一个针对损伤发生应答的细胞。在短暂性前脑缺血模型中,发现小胶质细胞的反应早在20分钟内即发生。外伤性脑损伤后有IL-6、IL-10、IL-1、IFN-γ等炎性细胞因子表达增高,且其血浆含量可作为反映伤情严重程度的可靠指标。IL-6在创伤性炎症反应的发生发展过程中起重要的作用,属于致伤因子,具有启动和促进炎症反应的作用,与损伤的严重程度密切相关。然而,小胶质细胞是否在DAI后被激活,是否与促炎因子IL-6一起参与了二次打击的过程,从而导致其自身及神经元的进一步损伤目前尚不清楚。本实验采用Marmarou A等人于1994年首次报道的自由落体撞击方法复制大鼠DAI模型,观察小胶质细胞是否在DAI后被激活,促炎因子IL-6的表达情况,进一步探讨DAI后的神经组织中神经元和小胶质细胞的相互作用,及损伤后炎症反应和细胞损伤的关系,为进一步阐明DAI的病理生理学机制奠定基础。方法:健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只,体重300克左右,随机分为正常对照组、假手术组和打击后不同时间组(0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、5d和7d)。正常对照组大鼠不作处理;假手术组大鼠给予手术及打击前处理,但不予真正的打击;打击组大鼠经过手术后,给予打击,打击后按不同时间处死。观察打击后大鼠的行为学表现,麻醉灌注后取全脑,制作石蜡切片,采用HE染色、银染、焦油紫尼氏小体染色和Weil’s铁苏木素髓鞘染色的方法观察大鼠脑组织的病理改变。将经以上方法验证符合标准的大鼠列入打击组,用免疫组织化学的方法测定脑组织中各个脑区小胶质细胞激活标志物CD11b及IL-6在损伤后不同时间点的表达情况。计量资料数据用均数±标准差(Mean±SD)表示,用SPSS统计分析软件进行统计学分析,各组均数的比较行单因素方差分析(ANOVA),用最小显著差法(LSD)作两两比较,P<0.05为有显著性差异。结果:1组织病理学变化:HE染色形态学变化:正常对照组与假手术对照组的大鼠脑组织结构清晰,均匀致密;打击组大鼠大脑皮层、脑干等部位可见局灶性点状出血,大鼠打击后6h开始出现脑组织充血水肿,24h达高峰,48h以后肿胀有所减轻。Bielschowsky’s镀银染色轴索的形态学变化:正常对照组与假手术对照组大鼠脑组织结构清晰,神经元轴突直且长,表面光滑;打击组大鼠打击后12h可见胼胝体、脑干和小脑等部位神经轴索扭曲、肿胀,呈串珠状、波浪状改变,周围间质水肿,上述表现于24h及48h更加明显,5d明显好转。Weil’s髓鞘染色髓鞘的形态学变化:正常对照组与假手术对照组大鼠脑组织结构清晰,均匀致密,髓鞘横切面呈环状,纵切面呈鱼刺状;打击组大鼠打击后6h可见大鼠脑干等部位损伤轴索的周围髓鞘间隙明显增宽,髓鞘显著疏松、水肿及崩解出现空白区,上述改变在12h、24h和48h更加明显,5d明显好转。Cresyl violet染色神经元尼氏小体的形态学变化:正常对照组与假手术对照组大鼠脑组织结构清晰,脑干、皮质和小脑等部位神经元内可见呈蓝紫色,细小颗粒状,均匀致密,环绕在细胞核的周围的尼氏小体;打击组大鼠打击12h后可见脑干等部位损伤轴索的周围神经元淡染出现空白区,尼氏小体明显减少,且呈粗大颗粒状,上述改变在24h和48h显著,5d明显好转。2 CD11b阳性小胶质细胞在不同时间点的活化:正常对照组与假手术对照组大鼠脑组织CD11b阳性小胶质细胞淡染,呈棕黄色、分枝状,胞体小,具有伸向各个方向的细小突起;打击组大鼠打击后3h可见皮层、小脑、脑干等脑区的小胶质细胞CD11b表达升高,主要分布于损伤轴索及小血管的周围,且与对照组有明显差异(P<0.05),其表达量12h时增高达到峰值,活化的小胶质细胞数量明显增加,突起变短、变粗,胞体增大、变圆,CD11b表达于24h后开始下降,72h后明显低于12h组,但与对照组仍然有明显的差异(P<0.05)。3 DAI后IL-6在不同时间点的表达:正常对照组与假手术对照组大鼠的脑组织IL-6有表达,其量很低;打击组大鼠打击后6h可见皮层、小脑、脑干等损伤部位脑区神经细胞有IL-6表达的升高,与对照组有明显差异(P<0.05),12h至24h表达量增高达到峰值,48h其表达开始下降,7d时IL-6的表达较24h有非常明显的降低,但较对照组仍然有明显的差异(P<0.05),阳性细胞主要是神经胶质细胞,神经元也有一定量IL-6的表达。结论:采用Marmarou A的自由落体撞击方法复制了大鼠弥漫性轴索损伤模型;DAI后脑组织中CD11b阳性小胶质细胞活化,12h达到峰值;DAI后大鼠脑组织中IL-6的表达升高,12h达到峰值,阳性细胞主要是神经胶质细胞,神经元也有一定量IL-6的表达。
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