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DNA shuffling技术在解除AroG所受苯丙氨酸反馈抑制中的应用

作　者: 李晓萍
导　师: 黄伟达
学　校: 复旦大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: DAHP合成酶 aroG aroF aroH DNA shuffling Phe反馈抑制
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

L型苯丙氨酸(L-Phe)是人体八种必需氨基酸之一,在新陈代谢过程中作用重要,广泛应用于医药、食品、农业、化妆品和工业用品等领域。其生产方法有化学合成法和微生物发酵法。直接化学合成苯丙氨酸工艺复杂,成本较高,基本上被取代。自从1957年Kyowa Hakko公司利用微生物发酵得到L-Phe以来,微生物发酵法越来越多的被用于氨基酸的生产。现有的Phe生产菌株大多是经重复诱变的酪氨酸缺陷或类似物抗性筛选的突变株,实际产量不能尽如人意。研究者亟待选育高产的Phe基因工程菌株,以满足不断扩张的市场需求。aroG基因编码的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(AroG)是苯丙氨酸代谢途径中的关键酶,催化限速步骤E4P和PEP生成DAHP的反应,受到苯丙氨酸的反馈抑制。在大肠杆菌中,有三种DAHP合成酶同工酶：DAHP合成酶(Phe)由aroG基因编码,DAHP合成酶(Trp)由aroH基因编码,DAHP合成酶(Tyr)由aroF基因编码。三者分别受到三种芳香族氨基酸苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的反馈抑制。本论文在以前实验室研究基础上,以E. coli野生型aroG、aroH和aroF基因为亲本,通过DNA shuffling的方法对aroG进行改组,在6 mg/ml pFP平板上筛选到471个阳性克隆。将筛选到的阳性基因再次进行DNA shuffling,然后在7.5 mg/ml pFP平板上筛选到26个阳性克隆,将这26个阳性克隆点板到10mg/ml pFP平板上,获得2个在更高程度上解除苯丙氨酸反馈抑制的克隆。将这2个克隆送去测序,其中一个发生了C129T,A531G,A1032G三个点突变；另一个发生了三个点突变T77A,G883A,A1032G和四个碱基的插入突变922位插入A,943位插入CG,971位插入A。这些点突变造成的氨基酸的变化对酶蛋白的折叠构象有重要的意义,比如中性氨基酸变成碱性氨基酸或者带巯基的氨基酸。碱基的插入突变更是改变了阅读框和随之的蛋白质的翻译。本研究筛选到的突变基因位点是实验室之前的研究中没有的,因此,本研究中将pFP筛选水平提高到了7.5mg/ml。分析序列之后,进行改组AroG的表达与纯化和酶学性质的测定,结果表明改组AroG与野生型相比,在最适温度和最适pH值方面都有所变化。

全文目录

目录  3-4
缩略词  4-5
摘要  5-6
ABSTRACT  6-7
文献综述  7-39
材料与方法  39-47
结果  47-56
讨论  56-58
参考文献  58-66
致谢  66-67

DNA shuffling技术在解除AroG所受苯丙氨酸反馈抑制中的应用

内容摘要

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