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利用DNA Shuffling技术改造抗虫Bt基因的研究

作　者: 张小琼
导　师: 李拥军
学　校: 华中农业大学
专　业: 生物化学与分子生物化学
关键词: 苏云金芽胞杆菌 DNA shuffling cry1Ab cry1Ac cry1C* cry2A* cry9C* 结构功能
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 37次
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内容摘要

Bacillus thuringiensis是一类广泛存在于土壤、灰尘、植物、水和昆虫中,革兰氏阳性,在生长的某个时期形成芽孢和伴孢晶体的杆菌。许多具有对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、直翅目特异杀虫活性的Cry蛋白被分离出来。尽管已经有许多有效的突变方法已经用于研究Cry蛋白,但是依然有一定的局限性。本研究就是使用DNA shuffling技术来创造一个拥有各种不同突变和突变位点的巨大突变体库。本试验以改造合成的5个Bt基因(crylAb、crylAc、crylC*、cry2A和cry9C*)为材料,利用DNA shuffling这一体外分子进化技术,构建了一个含有1000个重组基因克隆的大肠杆菌表达库；通过诱导表达重组蛋白,以棉铃虫为试验昆虫进行蛋白毒性实验。并对这1000个重组克隆进行了测序,通过对这些重组基因与原始5个基因进行序列同源性比较。发现与crylAb、crylAc、crylC*、cry2A*和cry9C*具有序列相似性的克隆分别为235个、186个、16个、420个和88个,未知序列55个。1000个重组克隆中筛选到毒性增强的重组克隆主要是与cry2A基因同源。crylAc来源重组克隆组中,表达蛋白杀虫数目高于对照CrylAc的克隆为5个,持平的有2个,毒性降低的为179个,其中完全丧失毒性的克隆有116个。420个来源于cry2A*的重组克隆毒力测定结果显示,杀虫效果明显提高的克隆有132个；毒力持平的克隆有6个；毒力下降的克隆有282个。与crylAb有序列相似性的有235个,在1000个重组克隆中数量居于第二位。其杀虫毒力略低于CrylAc,但是在杀虫数最多的10个重组基因中,也只有1个克隆977来源于crylAb,这一点和crylAc相同。来源于crylC*的重组杀虫蛋白数量最少,仅为16个。这可能是因为该蛋白在基因同源性上与其他4个基因存在较大差异。来源于cry9C*的重组蛋白所占1000个重组克隆的比例为8.8%。相较其他基因也较少。其中来源于cry9C*的重组蛋白绝大部分为失去毒力或者降低毒力。在毒性降低或丧失的克隆中,多数是产生了移码突变导致大量的氨基酸序列的改变,部分则是由于末端序列的移码、提前出现终止密码等因素。而毒性与原始基因相当的克隆则是由于所表达的氨基酸序列没有变异,或者氨基酸突变的位点位于三维结构外侧,对与膜结合的能力和杀虫毒力均没有影响。分析了crylAc和cry2A*来源的克隆中单氨基酸位点突变对蛋白结构和功能的影响,发现毒性提高的重组克隆突变位点分布在3个结构域中,但大部分都位于结构域1和2中。突变的位点多为单个氨基酸或相邻的少数几个氨基酸,它们分布在整个蛋白的不同螺旋和折叠中。突变后的氨基酸如R127L、R127F能够提高结构域1的疏水性从而有利于整个三级结构的稳定。还有克隆305、323中的突变如T296H增加了结构域2的正电荷,有利于蛋白与带负电荷的膜受体结合。还观察到了一些突变热点位点,如cry1Ac来源克隆中第124、127、296位氨基酸,cry2A*来源克隆中的第12-14、25-28、140-146位氨基酸。DNA shuffling技术提供的这1000个突变体为我们研究重组后基因的突变位点、突变类型对蛋白毒力的影响提供了材料,通过分析该突变氨基酸所在结构域位置和理化性质对整个杀虫晶体蛋白的结构和功能的影响。同时也为转基因抗虫育种提供了新编码的高毒性蛋白的基因。

全文目录

中文摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
缩略词表  11-12
1 前言  12-31
  1.1 昆虫病理学和苏云金芽胞杆菌  12
  1.2 苏云金芽胞杆菌的发现  12-13
  1.3 苏云金芽胞杆菌的分类  13
  1.4 苏云金芽胞杆菌蛋白的分类  13-15
    1.4.1 δ-内毒素  14-15
      1.4.1.1 δ-内毒素的形态和结构  14
      1.4.1.2 蛋白质晶体的生化特性  14
      1.4.1.3 δ-内毒素的分类  14-15
    1.4.2 苏云金芽胞杆菌的其它毒素  15
      1.4.2.1 β-外毒素(β-exotoxin)  15
      1.4.2.2 α-外毒素(α-exotoxin)  15
      1.4.2.3 γ-外毒素(γ-exotoxin)  15
  1.5 苏云金芽胞杆菌蛋白质晶体毒素的致病机理  15-16
    1.5.1 杀虫晶体蛋白在昆虫中肠的降解  15-16
    1.5.2 杀虫晶体蛋白与中肠细胞膜受体的结合  16
  1.6 苏云金芽胞杆菌蛋白质晶体的三级结构及其功能  16-18
  1.7 苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白的应用  18-19
    1.7.1 苏云金芽胞杆菌生物制剂的发展  18-19
    1.7.2 转Rt植物研究进展  19
  1.8 蛋白质分子改造的途径  19-30
    1.8.1 随机诱变  20-22
      1.8.1.1 物理诱变  20
      1.8.1.2 化学诱变  20-21
      1.8.1.3 致错PCR(ERROR-PRONE PCR)  21-22
    1.8.2 定向诱变  22-30
      1.8.2.1 寡核苷酸介导的定点诱变  22
      1.8.2.2 引物定点引入法  22-23
      1.8.2.3 盒式诱变(cassette mutagenesis)  23
      1.8.2.4 重叠延伸PCR(overlap extension PCR,OE-PCR)  23-24
      1.8.2.5 大引物PCR法(megaprimer PCR)  24
      1.8.2.6 DNA改组(DNA shuffling)  24-28
      1.8.2.7 StEP重组  28
      1.8.2.8 核酸交换切割的DNA改组技术  28
      1.8.2.9 随机引物体外重组法  28
      1.8.2.10 渐增切割法产生杂和酶  28-29
      1.8.2.11 过渡模板随机嵌合生长  29
      1.8.2.12 不依赖序列同源性的蛋白质重组  29-30
  1.9 研究的目的与意义  30-31
2 材料和方法  31-35
  2.1 实验材料  31
    2.1.1 基因来源  31
    2.1.2 菌株和载体  31
      2.1.2.1 主要菌株  31
      2.1.2.2 主要载体  31
  2.2 实验方法  31-35
    2.2.1 扩增5个Cry杀虫蛋白原始基因片段  31-32
    2.2.2 基因的片段化  32
    2.2.3 基因片段的重组  32
    2.2.4 重组片段与载体连接  32
    2.2.5 包含重组蛋白的阳性克隆筛选  32-33
    2.2.6 重组基因的序列测序  33
    2.2.7 重组基因的序列比对  33
    2.2.8 重组蛋白氨基酸性质分析软件  33-34
    2.2.9 重组基因在大肠杆菌中的诱导表达  34
    2.2.10 重组蛋白的杀虫毒力测定  34
    2.2.11 重组克隆Cry蛋白含量测定  34-35
    2.2.12 重组蛋白杀虫数统计软件  35
3 结果与分析  35-59
  3.1 1000个重组基因克隆的获得  35-36
  3.2 1000个重组克隆核苷酸序列的测定  36-38
  3.3 1000个重组克隆杀虫毒力的测定方法的确定  38-39
  3.4 5个cry基因来源的重组克隆的不同杀虫效果的克隆数比较  39-40
  3.5 不同杀虫效果组内部克隆氨基酸序列的同源性比较  40
  3.6 cry1Ac来源的重组克隆相关实验结果和分析  40-51
    3.6.1 cry1Ac重组克隆的毒力测定结果  40-41
    3.6.2 cry1Ac来源的杀虫毒性提高的重组蛋白中突变分析  41-46
      3.6.2.1 杀虫毒性提高的克隆的突变位点的分布  41-42
      3.6.2.2 毒力提高重组蛋白中氨基酸的理化性质变化对蛋白结构和功能的影响  42-46
    3.6.3 杀虫毒力持平重组克隆中存在的突变类型及毒性变化的原因分析  46-47
    3.6.4 杀虫毒性下降的重组克隆中存在的突变分析  47-51
  3.7 cry2A*来源的重组克隆相关实验结果和分析  51-58
    3.7.1 cry2A*重组克隆的毒力测定结果  51-52
    3.7.2 cry2A*来源的杀虫毒力提高的重组蛋白中突变分析  52-56
    3.7.3 cry2A*来源毒力持平和下降的克隆组中氨基酸突变分析  56-57
    3.7.4 cry2A*来源重组克隆的同源性的比较分析  57-58
    3.7.5 对突变后cry2A*来源克隆数量较多的原因分析  58
  3.8 cry1Ab来源的重组克隆序列相关实验结果和分析  58-59
  3.9 cry1C*来源的重组克隆序列相关实验结果和分析  59
  3.10 cry9C*源的重组克隆序列相关实验结果和分析  59
4 讨论  59-69
  4.1 cry1Ac来源的重组克隆突变结果的探讨  59-64
    4.1.1 cry1Ac来源的重组克隆突变的类型及规律  60-62
    4.1.2 Cry1A家族蛋白间的序列相关性分析  62-64
  4.2 cry2A*来源的重组克隆突变结果的探讨  64-69
    4.2.1 cry2A*来源的重组克隆突变的类型及规律  64
    4.2.2 Cry2A家族蛋白间的序列相关性分析  64-69
5 参考文献  69-79
附录1  79
附录2  79-80
在读期间发表论文  80-81
致谢  81

利用DNA Shuffling技术改造抗虫Bt基因的研究

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