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产茴香醛菌株Burkholderia WGB30的鉴定及其部分代谢产物的分析

作　者: 梁肖仍
导　师: 武波
学　校: 广西大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 茴香醛反式茴香脑生物转化伯克霍尔德氏菌正交试验气相色谱筛选
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

茴香醛是一种重要的有机中间体,它具有持久的山楂香气和较强的抗氧化性能,广泛应用于食品、医药及日用化学工业。目前茴香醛产品主要是通过化学法制备,存在严重弊端,新开发的电氧化工艺和臭氧化工艺,虽在环境问题上得到了极大改善,但反应条件苛刻、设备要求高,工业化困难。因此,寻求一条经济有效、环境友好的茴香醛制备途径是一个值得研究的课题。本研究以八角茴香油为原料,通过富集培养和分离纯化,从八角环境中筛选到320株能以反式茴脑作为唯一碳源的菌株,经薄层层析法、紫外分光光度法和气相色谱法相结合对转化液进行分析,结果获得一株相对高产茴香醛的细菌菌株WGB30,茴香醛的摩尔转化率达5.08%。经形态学、生理生化实验、Biolog EcoPlates鉴定以及16SrDNA序列同源性分析,初步鉴定菌株WGB30为伯克霍尔德氏菌Burkholderia sp.。试验探讨了培养基主要组成、培养条件(起始pH、温度、装液量、转速和转化时间)、种子生长时间、生物量、乳化剂以及底物的添加时间和添加量对菌株WGB30生成茴香醛能力的影响。通过单因素试验和正交试验得出菌株WGB30生成茴香醛的最佳培养基主要组成为：葡萄糖20g/L,蛋白胨8g/L；最佳培养条件为：初始pH6.5,培养温度28℃,装液量60ml/250ml,转速180rmp,转化时间3d；在上述发酵条件下,茴香醛的摩尔生成率可达11.42%,约为优化前的2倍。采用气相色谱-质谱联用仪分析Burkholderia WGB30转化反式茴脑的代谢产物,结果获得三种产物,分别为茴香醛、茴香酸和N-甲基对甲苯胺,并对Burkholderia WGB30代谢反式茴脑途径进行了初步的推测。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
第一章文献综述  12-22
  1.1 八角茴香的研究概况  12
  1.2 八角茴香油  12
  1.3 八角茴香(Illicium verum)的化学成分  12-13
    1.3.1 挥发性化合物  12-13
    1.3.2 倍半萜内酯及其衍生物  13
    1.3.3 黄酮类成分  13
    1.3.4 苯丙烷和木脂素类  13
    1.3.5 其它  13
  1.4 八角茴香的药用价值  13-14
    1.4.1 抑菌作用  13
    1.4.2 升高白细胞作用  13-14
    1.4.3 镇痛作用  14
    1.4.4 抗氧化性  14
    1.4.5 杀虫作用  14
    1.4.6 其它作用  14
  1.5 茴香醛  14-15
    1.5.1 理化性质  14-15
    1.5.2 茴香醛的应用  15
  1.6 茴香醛制备工艺的研究进展  15-17
    1.6.1 茴香脑氧化法  15-16
    1.6.2 基础化工原料法  16-17
  1.7 生物技术在香料中的研究进展  17
  1.8 微生物代谢茴香脑的研究进展  17-18
  1.9 检测方法的分析  18-20
    1.9.1 气相色谱法  18-19
    1.9.2 薄层层析法  19
    1.9.3 紫外分光光度法  19
    1.9.4 其他方法  19-20
  1.10 立题背景和意义  20
  1.11 研究的主要内容及技术路线  20-22
第二章材料与方法  22-35
  2.1 样品来源  22
  2.2 培养基、培养条件及菌种保存  22-23
    2.2.1 培养基  22
    2.2.2 培养条件  22-23
    2.2.3 菌种保存  23
  2.3 主要药品及仪器  23-24
  2.4 溶液、缓冲液和试剂  24
  2.5 检测方法的建立  24-26
    2.5.1 紫外分光光度法  24
    2.5.2 薄层色谱法  24-25
    2.5.3 气相色谱法  25-26
  2.6 样品的富集培养  26
  2.7 菌株的分离纯化及筛选  26
    2.7.1 初筛  26
    2.7.2 复筛  26
  2.8 目的菌株的鉴定  26-33
    2.8.1 形态学观察  26-27
    2.8.2 生理生化鉴定  27-29
    2.8.3 Biolog鉴定  29
    2.8.4 16SrDNA鉴定  29-33
  2.9 目的菌株转化茴脑产茴香醛的条件优化  33
    2.9.1 菌体生物量的测定  33
    2.9.2 底物和产物浓度的测定  33
  2.10 菌株耐受茴香脑及茴香醛分析  33-34
  2.11 菌株的诱变育种  34-35
    2.11.1 紫外诱变  34
    2.11.2 微波诱变  34
    2.11.3 亚硝酸诱变  34-35
第三章产茴香醛菌株的筛选  35-45
  3.1 发酵液预处理的方法研究  35-36
  3.2 菌株的筛选  36-39
    3.2.1 以茴香脑为唯一碳源的菌株筛选  36
    3.2.2 可耐受高浓度茴香脑的菌株筛选  36
    3.2.3 能够转化茴脑并积累茴香醛的菌株筛选  36-39
  3.3 实验菌株WGB30的鉴定  39-44
    3.3.1 形态学及培养特征  39
    3.3.2 生理生化实验  39
    3.3.3 Biolog鉴定  39-40
    3.3.4 16SrDNA的鉴定  40-42
    3.3.5 16SrDNA PCR产物的测序分析  42-44
  3.4 菌株WGB30耐受反式茴香脑的分析  44-45
第四章菌株WGB30转化茴脑产茴香醛的条件优化  45-59
  4.1 碳源选择  45-47
    4.1.1 不同碳源对菌体增殖的效果  45-46
    4.1.2 葡萄糖浓度的确定  46-47
  4.2 氮源选择  47-48
    4.2.1 不同氮源对生长和转化的影响  47
    4.2.2 最佳蛋白胨浓度的选择  47-48
  4.3 培养条件对生长和转化的影响  48-51
    4.3.1 初始pH  48-49
    4.3.2 温度  49
    4.3.3 装液量  49-50
    4.3.4 发酵时间  50-51
    4.3.5 转速  51
  4.4 影响转化的其他因素  51-53
    4.4.1 种子生长时间的确定  51-52
    4.4.2 生物量  52
    4.4.3 乳化剂对转化影响  52-53
  4.5 添加茴脑的研究  53-55
    4.5.1 茴脑的添加时间  53-54
    4.5.2 茴脑的添加量  54-55
  4.6 正交试验  55-57
  4.7 验证试验  57-58
  4.8 诱变育种  58-59
第五章菌株WGB30代谢茴香脑的途径分析  59-67
  5.1 菌株WGB30在不同碳源培养基的生长比较  59
  5.2 菌株WGB30对茴脑的耐受分析  59
  5.3 菌株WGB30对茴香醛的耐受及代谢分析  59-61
  5.4 菌株WGB30转化茴香脑的GC-MS检测  61
  5.5 HRMS鉴定代谢产物  61-64
  5.6 代谢茴香脑的途径分析  64-67
第六章结果与讨论  67-70
  6.1 结果  67-68
  6.2 讨论  68-70
参考文献  70-75
附录  75-76
致谢  76-77
攻读硕士学位期间发表的论文  77

产茴香醛菌株Burkholderia WGB30的鉴定及其部分代谢产物的分析

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