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水稻白叶枯病菌致病性功能基因组学分析

作　者: 黄贵修
导　师: 黄俊生；何朝族
学　校: 华南热带农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 水稻白叶枯病菌 全基因组测序 致病性 突变 xps基因簇 flgK基因 aroG基因 无毒基因
分类号: S435.111
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


革兰氏阴性菌水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的白叶枯病是水稻(Oryza sativa L.)生产上最严重的细菌性病害,它也是研究植物——病原互作的重要模式菌。为研究Xoo致病分子机制,开展致病基因功能基因组学分析,我们用近年来广为使用的“鸟枪法”(shotgun)测序策略对PR6菌株基因组全序列进行测定。构建三套高质量基因组文库,用小片段文库进行大规模序列测定。迄今己完成21211 reads测序工作,测序总长度达16459736 bp,约3.3倍基因组序列覆盖率。序列经初步组装获得529个Contigs,长度达4.94 Mb,得到了PR6菌株基因组全序列基本框架。组装序列分析发现,框架序列中能找到4555个(98.23%)编码蛋白基因序列与Xoo KACC 10331菌株序列高度同源。这为进一步确定和分离Xoo致病基因及其功能基因组学分析奠定了基础。 通过致病性分析,从17184个Tn5转座子插入突变体库中筛选到在水稻感病品种IR24上致病性明显下降或完全丧失的突变体332个。对其中的112个突变体Southern blot分析表明,有105个突变体(93.76%)的转座子在基因组上为单拷贝插入。在PSA培养基上,大多数致病性相关突变体的培养特征与野生型相同,能正常分泌胞外酶。通过TAIL-PCR分离的转座子侧翼片断属于46个基因,还有14个突变体的插入位点位于内源转座子或启动子上或基因间。41个已经确定功能的基因中与分泌系统有关的超过三分之一(15个),说明分泌系统对致病性有重要作用。其它主要是一些与胞外多糖、脂多糖合成有关及与细菌基础代谢和基因调节相关的基因。 有15个突变体的转座子插入位点分别位于Ⅱ型分泌系统xps基因簇的6个基因上,PCR、Southern blot证实突变体确为转座子插入引起。突变体生长培养特征、胞外多糖分泌与野生型无明显差异,但胞外酶不能有效分泌。通过测序和PCR方法得到11037 bp的xps基因簇全长序列,并克隆了其中的6个xps基因;序列同源性分析发现,PR6菌株的xps基因簇与其它病原黄单胞菌小种的序列同源性很高。初步的xps基因簇的SDS-PAGE、RT-PCR和Western blot分析发现,xps基因除共同启动子外,基因内可能还存在一些各自的启动子;突变体中至少有两种蛋白在胞间周质累积,其中有一种蛋白可能编码木聚糖酶。 在112个致病性相关突变体中,发现有一转座子插入到编码芳香族氨基酸代谢途径DAHP合成酶基因(aroG基因)上的突变株。突变株在感病水稻品种IR24上的生

全文目录


第一章 文献综述  11-73
  1 植物病原细菌致病性功能基因组学研究进展  11-33
    1.1 植物病原细菌与水稻白叶枯病  11-12
    1.2 植物病原细菌致病相关基因  12-33
      1.2.1 植物病原细菌致病性毒力因子基因  12-16
      1.2.2 植物病原细菌致病性效应因子基因  16-25
      1.2.3 植物病原细菌分泌系统及其表面附着结构  25-33
  2 细菌基因组全序列框架(scalfold)搭建策略概述  33-45
    2.1 细菌基因组全序列鸟枪法测定  34-39
    2.2 基于排定顺序的大片段克隆基因组全序列测定  39-40
    2.3 其它测序方法  40-41
    2.4 细菌基因组全序列组装及完成  41-45
  3 植物病原细菌致病机理分子遗传学分析方法  45-49
    3.1 分离致病基因常用方法  45-46
    3.2 鉴定致病基因主要实验技术  46-49
  4 水稻白叶枯病菌致病机理研究进展  49-55
  5 博士论文选题意义及技术路线  55-56
  参考文献  56-73
第二章 水稻白叶枯病菌PR6菌株基因组全序列初步测定  73-109
  1 材料和方法  74-94
    1.1 实验材料  74-77
    1.2 实验方法  77-94
      1.2.1 水稻白叶枯病菌基因组DNA制备  77-80
      1.2.2 pUC18载体制备  80-83
      1.2.3 小片段(1.6～4.0kb)基因组文库构建  83-89
      1.2.4 大片段(8.0～10.0kb)基因组文库构建  89-92
      1.2.5 大规模测序模板制备  92-93
      1.2.6 大规模序列测定  93-94
      1.2.7 基因组序列组装  94
  2 结果与分析  94-98
    2.1 水稻白叶枯病菌基因组DNA制备  94
    2.2 小片段文库构建与质量评价  94-96
    2.3 大片段文库构建与质量评价  96-97
    2.4 小片段文库质粒大规模制备及测序  97
    2.5 基因组序列组装  97-98
  3 讨论  98-103
  小结  103
  参考文献  103-109
第三章 水稻白叶枯病菌致病基因筛选及分子分析  109-153
  1 材料和方法  110-124
    1.1 实验材料  110-113
    1.2 实验方法  113-124
      1.2.1 突变体库中致病基因突变体筛选  113-114
      1.2.2 致病性相关突变体基本生化特性测定  114-115
      1.2.3 水稻白叶枯病菌基因组DNA提取  115
      1.2.4 致病性相关突变体PCR检测  115-116
      1.2.5 致病性相关突变体中转座子插入拷贝数确定  116-117
      1.2.6 致病性相关突变体中转座子侧翼片段分离  117-121
      1.2.7 致病性相关突变体中转座子侧翼序列测定  121
      1.2.8 flgK基因突变体表型分析  121-124
  2 结果与分析  124-134
    2.1 水稻白叶枯病菌致病性相关突变体获得  124-125
    2.2 致病性相关突变体基本生化特征  125-126
    2.3 致病性相关突变体分子分析  126-129
    2.4 致病性相关突变体中转座子侧翼序列分析  129-130
    2.5 flgK基因突变体表型分析  130-134
  3 讨论  134-139
  小结  139
  参考文献  139-153
第四章 水稻白叶枯病菌Ⅱ型分泌系统xps基因簇遗传分析  153-176
  1 材料和方法  154-162
    1.1 实验材料  154-155
    1.2 实验方法  155-162
      1.2.1 xps基因簇序列确定与同源性分析  155-156
      1.2.2 xps基因突变体分子鉴定  156-157
      1.2.3 xps基因突变体胞外酶活性检测  157-158
      1.2.4 xps基因突变体细胞不同部分蛋白SDS-PAGE检测  158-159
      1.2.5 xps基因突变体细胞不同部分蛋白Western blot分析  159-160
      1.2.6 xps基因突变体RT-PCR分析  160-162
  2 结果与分析  162-168
    2.1 xps基因簇序列确定与同源性分析  162-163
    2.2 xps基因突变体分子分析  163-165
    2.3 xps基因突变体胞外酶活性分析  165-167
    2.4 xps基因突变体细胞不同部分蛋白SDS-PAGE分析  167
    2.5 xps基因突变体细胞不同部分蛋白Western blot分析  167-168
    2.6 xps基因突变体RT-PCR分析  168
  3 讨论  168-170
  小结  170
  参考文献  170-176
第五章 水稻白叶枯病菌aroG基因的克隆与功能初步分析  176-203
  1 材料和方法  178-187
    1.1 实验材料  178-179
    1.2 实验方法  179-187
      1.2.1 aroG基因突变体在水稻叶片中的繁殖与扩展测定  179-180
      1.2.2 aroG基因突变体基本生化特性测定  180-181
      1.2.3 aroG基因的克隆  181-182
      1.2.4 aroG基因序列分析  182
      1.2.5 aroG基因突变体分子分析  182-184
      1.2.6 DAHP合成酶活性测定  184
      1.2.7 aroG基因敲除(Knockout)分析  184-187
  2 结果与分析  187-196
    2.1 aroG基因突变体在水稻叶片中的繁殖与扩展分析  187-189
    2.2 aroG基因突变体基本生化特征  189-190
    2.3 aroG基因序列分析  190-193
    2.4 aroG基因突变体分子分析  193-195
    2.5 DAHP合成酶活性测定  195
    2.6 aroG基因敲除(Knockout)分析  195-196
  3 讨论  196-199
  小结  199
  参考文献  199-203
第六章 水稻白叶枯病菌无毒基因筛选及分子分析  203-228
  1 材料和方法  204-211
    1.1 实验材料  204-206
    1.2 实验方法  206-211
      1.2.1 PR6菌株突变体库中无毒基因突变体筛选  206
      1.2.2 无毒基因突变体在水稻近等位基因系上的致病反应测定  206-207
      1.2.3 无毒基因突变体基本生化特性测定  207-208
      1.2.4 水稻白叶枯病菌基因组DNA提取  208
      1.2.5 无毒基因突变体分子检测  208-210
      1.2.6 无毒基因突变体中转座子侧翼片段分离与序列测定  210
      1.2.7 PR6菌株基因组文库构建  210
      1.2.8 PR6菌株基因组文库中无毒基因突变体克隆筛选  210-211
      1.2.9 部分无毒基因突变体基因片段在不同Xoo小种中的同源性检测  211
  2 结果与分析  211-217
    2.1 水稻白叶枯病菌无毒基因突变体获得  211-212
    2.2 无毒基因突变体在水稻近等位基因系上的致病反应分析  212-215
    2.3 无毒基因突变体基本生化特征  215
    2.4 无毒基因突变体分子分析  215-216
    2.5 无毒基因突变体转座子侧翼序列分析  216
    2.6 PR6菌株基因组文库中无毒基因突变体克隆筛选  216-217
    2.7 部分无毒基因突变体基因片段在不同Xoo小种中的同源性分析  217
  3 讨论  217-221
  小结  221
  参考文献  221-228
博士期间发表的论文  228-229
缩略词表  229-231
致谢  231-232

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害 > 病害
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