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枝状枝孢霉MD2基因工程菌株的构建

作　者: 刘婷婷
导　师: 余龙江
学　校: 华中科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 紫杉醇枝状枝孢霉MD2 根癌农杆菌介导的转化工程菌株 dbat
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

紫杉醇是一种高效、低毒、广谱的抗肿瘤药物。利用微生物发酵法生产紫杉醇是解决紫杉醇药源紧缺问题的有效途径之一。然而目前分离的大部分紫杉醇产生菌,其合成紫杉醇的产量都很低,尚无法进行大规模工业化生产应用。本研究希望通过基因工程技术对紫杉醇产生菌进行遗传改造,构建紫杉醇高产的基因工程菌株,为其产业化的应用提供优良的种质资源。基于以上目的,本论文在已经建立的根癌农杆菌LBA4404介导的产紫杉醇真菌枝状枝孢霉MD2遗传转化体系的基础上进行了以下研究:(1)从曼地亚红豆杉细胞中克隆了紫杉醇合成途径中的关键酶10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10β-乙酰转移酶基因(dbat);(2)将dbat基因克隆到pBI121质粒上,替换掉gus基因,构建了CaMV35S-dbat -Nos表达框,然后将35S-dbat-Nos表达框克隆到pCAMBIA1303质粒的多克隆位点,构建了用于遗传转化的表达载体p1303-SdbatN,并采用电转的方法将p1303-SdbatN载体转入根癌农杆菌LBA4404中;(3)以枝状枝孢霉MD2的孢子为受体,采用根癌农杆菌LBA4404介导的转化方法,将载体p1303-SdbatN导入到枝状枝孢霉MD2中,并在含有30μg/mL潮霉素和100μg/mL头孢霉素的选择培养基上,筛选阳性转化子;(4)随机选择6株阳性转化子,通过PCR扩增潮霉素抗性基因(hph)来检测分析T-DNA的插入情况,结果表明,6株阳性转化子均能扩增出hph基因条带,这说明T-DNA已经插入到枝状枝孢霉MD2的基因组中。进一步通过Southern blot分析T-DNA在宿主基因组中的整合方式,结果表明:根癌农杆菌LBA4404介导的枝状枝孢霉MD2的转化多为单拷贝随机插入;(5)通过Western blot和荧光检测分析报告基因gfp的表达情况,结果表明,报告基因gfp在35S启动子的调控下能够在枝状枝孢霉MD2中得到表达;(6)将枝状枝孢霉MD2阳性转化子接到不含潮霉素的培养基上连续培养5代后,再转接到含有潮霉素的选择培养基上,对转化子进行遗传稳定性检测,发现转化子在无潮霉素选择压力的条件下,仍然保持潮霉素的抗性,说明T-DNA插入的稳定性,也说明该转化方法稳定可靠;(7)通过HPLC检测阳性转化子的紫杉醇产量,获得1株紫杉醇产量明显提高的工程菌株,其紫杉醇产量为野生菌紫杉醇产量的3倍。该研究工作为将来利用微生物发酵生产紫杉醇的工业化奠定了基础。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-10
1 绪论  10-21
  1.1 紫杉醇概述  10-11
  1.2 红豆杉概述  11
  1.3 紫杉醇的药源开发  11-13
  1.4 紫杉醇生物合成途径及相关酶研究进展  13-14
  1.5 产紫杉醇内生真菌研究进展  14-17
  1.6 丝状真菌遗传转化方法概述  17
  1.7 根癌农杆菌介导的真菌遗传转化方法  17-19
  1.8 研究目的和内容  19-21
2 材料和方法  21-45
  2.1 实验材料  21-26
  2.2 实验方法  26-45
3 结果与讨论  45-60
  3.1 抗性筛选标记的确定  45-46
  3.2 表达载体的构建  46-48
  3.3 农杆菌转化子的鉴定  48-49
  3.4 枝状枝孢霉MD2 阳性转化子的检测  49-55
  3.5 转化子的稳定性分析  55-56
  3.6 枝状枝孢霉MD2 转化子的紫杉醇产量检测  56-58
  3.7 讨论  58-60
4 结论与展望  60-61
  4.1 本论文的主要结论  60
  4.2 展望  60-61
致谢  61-62
参考文献  62-68
附录1 攻读学位期间完成论文目录  68

枝状枝孢霉MD2基因工程菌株的构建

内容摘要

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