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扩展青霉脂肪酶的定点突变及随机突变

作　者: 陈国仁
导　师: 林琳
学　校: 福建师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 扩展青霉脂肪酶 定点突变 随机突变 最适作用温度 热稳定性
分类号: TQ925.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
下　载: 303次
引　用: 4次
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内容摘要


本研究利用定点突变和随机突变的技术手段。对扩展青霉脂肪酶(Penicillium expansum lipase,PEL)进行了最适作用温度、高温稳定性及低温适应性的蛋白质工程改造,结果如下: 1、PEL基因的定点突变 采用重叠延伸PCR的方法对PEL基因进行了E83V、T88P、K226R、E54P的定点突变,利用大引物PCR的方法进行了E214P的突变。突变基因在毕赤酵母GS115中表达,对突变体的最适作用温度和热稳定性的研究结果表明:突变体PEL-E83V-GS的最适作用温度提高了5.0℃,其比活约为野生型的2倍,热稳定性略有下降。说明了突变后疏水性较强的氨基酸Val可能增加了酶分子的表面疏水性,从而提高酶分子的疏水性包装效率;突变体PEL-E214P-GS的最适作用温度比野生型提高了7.5℃,热稳定性也提高了2.4℃,体现了Pro对热稳定性的特殊贡献:突变体PEL-T88P-GS的最适作用温度比野生型提高了2.5℃,但热稳定性无明显变化,而点E54P突变后则完全失去酶活:突变体PEL-K226R-GS的最适作用温度比野生型提高了5.0℃,但热稳定性和酶活有所下降。说明了Arg替换Lys后,脂肪酶与底物可能形成了额外的氢键,但同时也可能形成了空间位阻。 2、PEL基因的随机突变 用易错PCR的定向进化技术手段对PEL基因进行了随机突变,PCR产物与载体pPIC3.5K构建重组表达质粒,转化大肠杆菌构建突变文库。突变文库的混合质粒电转化毕赤酵母,通过对7000个重组菌的筛选,第一轮筛选出60个克隆子。然后进行第二轮摇瓶发酵复筛,得到一株低温适应性的突变体ep33,其最适作用温度为30.0℃,下降了10.0℃,其热稳定性也表现出低温酶的特性。核苷酸序列分析结果表明:601位的C突变为G,603位的C突变为G,即PEL基因163位的Pro(CCC)突变为Ala(GCG)。

全文目录


内容提要  2-3
Abstract  3-6
目录  6-5
序言  5-9
第一部分 文献综述  9-32
  1 简介  9
  2 蛋白质的稳定性  9-12
    2.1 酶热稳定性的定义  10
    2.2 热稳定性酶的优点  10-11
    2.3 热稳定性酶在工业上的应用  11-12
  3 酶的热失活  12-13
  4.影响蛋白质热稳定性的分子因素  13-20
    4.1 氢键  14-15
    4.2 疏水作用  15
    4.3 包装效率  15-16
    4.4 盐桥  16
    4.5 降低构象张力  16-17
    4.6 降低去折叠熵值  17-19
    4.7 稳定α—螺旋  19-20
    4.8 稳定环肽链结构  20
  5.提高蛋白质热稳定性的策略  20-32
    5.1 环境选择法  20-21
    5.2 蛋白质工程法  21-29
    5.3 酶固定化法  29-30
    5.4 酶化学修饰法  30
    5.5 添加共溶剂法  30-32
第二部分 材料与方法  32-48
  1.材料  32-35
  2.实验方法  35-48
    2.1 PEL-E83V定点突变  35-41
      2.1.1 突变基因的获得(重叠延伸PCR法)  35-36
      2.1.2 突变体克隆载体的构建  36-37
      2.1.3 突变体克隆载体的转化及筛选  37
      2.1.4 重组质粒DNA的制备  37-38
      2.1.5 PEL-E83V基因在巴斯德毕赤酵母中的表达  38-39
      2.1.6 表达产物PEL-E83V-GS的鉴定  39-40
      2.1.7 发酵上清脂肪酶酶活的测定  40-41
      2.1.8 表达蛋白PEL-E83V-GS最适反应温度和热稳定性的研究  41
    2.2 PEL-T88P定点突变  41-42
    2.3 PEL-E214P定点突变  42-44
    2.4 PEL-K226R和PEL-E54P定点突变  44-45
    2.5 PEL的随机突变  45-48
第三部分 结果与分析  48-67
  1.突变点的选择  48-49
  2.PEL—E83V定点突变  49-52
    2.1 突变基因lip-E83V的获得  49-50
    2.2 突变基因在毕赤酵母GS115中的表达  50-51
    2.3 PEL-E83V-GS最适作用温度和热稳定性的研究  51-52
  3.PEL-T88P定点突变  52-55
    3.1 突变基因lip-T88P的获得  52-53
    3.2 突变基因在毕赤酵母GS115中的表达  53
    3.3 PEL-T88P-GS最适作用温度和热稳定性的研究  53-55
  4.PEL-E214P定点突变  55-58
    4.1 突变基因lip-E214P的获得  55-56
    4.2 突变基因在毕赤酵母GS115中的表达  56
    4.3 PEL-E214P-GS最适作用温度和热稳定性的研究  56-58
  5.PEL-K226R定点突变  58-60
    5.1 突变基因lip-K226R的获得  58
    5.2 突变基因在毕赤酵母GS115中的表达  58-59
    5.3 PEL-K226R-GS最适作用温度和热稳定性的研究  59-60
  6.PEL-E54P定点突变  60-62
    6.1 突变基因lip-E54P的获得  60-61
    6.2 突变基因在毕赤酵母GS115中的表达  61-62
  7.PEL的随机突变  62-67
    7.1 易错PCR  62
    7.2 突变体的筛选  62-64
    7.3 突变体最适作用温度和热稳定性的研究  64-66
    7.4 突变体核苷酸序列分析  66-67
第四部分 小结与讨论  67-71
参考文献  71-79
英文缩略词表  79-80
在校期间发表的论文和参加学术会议的论文  80-81
中文详细摘要  81-84
致谢  84

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 酶制剂（酵素） > 脂肪酶
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