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人肝脏特异性OATP-C分子保守区阳离子氨基酸在硫酸盐雌酮转运中的作用

作　者: 杨聪
导　师: 陈文生
学　校: 第三军医大学
专　业: 内科学
关键词: OATP-C HEK293 突变体定点突变硫酸盐雌酮基因转染
分类号: R575
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

背景与目的:我们知道,肝脏是维持人体正常机能的重要器官,其主要功能之一是从门静脉血液中摄取一些毒性的有机化合物,在肝细胞中加工、转化、代谢,再分泌到胆汁中,经肠道随粪便排出体外,从而防止毒性物质在体内的聚集,发挥其解毒作用。肝脏摄取有机化合物溶质的功能在很大程度上主要由肝细胞膜上一组结构和功能相似的转运蛋白质介导,即有机阴离子转运多肽OATPs (Organic anion transporting polypeptides)[1]。OATPs是由具有转运有机阴离子底物特性的膜转运蛋白组成的大家族,目前已发现在OATPs家族中,大鼠11种、小鼠8种和人的9种成员,广泛分布于多种组织器官,如:肝、脑组织的血脑屏障和脉络膜丛、肺、心、肠、肾、胎盘和睾丸。这类转运蛋白的底物相当广泛,包括许多极性化的有机阴离子溶质,如胆汁酸盐、有机染料、固醇类鳌合物、甲状腺激素、阴离子寡肽、许多药物、抗生素类化合物、毒素等内源性和外源性物质。OATP-C(SLC21A6)是人肝脏中特异性表达的有机阴离子转运多肽,是OATPs (Organic anion transporting polypeptides)家族的重要成员,它分布在窦状间隙肝细胞基底侧膜上,参与肝脏摄取多种内源性和外源性有机溶质(如胆红素、多种药物和外源性有机毒素等),是肝脏药物代谢的重要环节。研究发现,OATP-C的底物非常广泛,主要有:胆红素及其葡萄糖甘酸、胆汁酸盐[2]、硫酸盐、多肽[2]及药物(如多种他汀类降脂药[阿伐他汀,西立伐他汀,氟伐地汀,匹伐他汀,罗苏伐他汀和辛伐他汀[3-8]],内皮素受体抑制剂阿曲生坦和波生坦[9–11],抗生素青霉素G和利福平[12,13],抗真菌药卡泊芬净[14],血管紧张素转换酶抑制剂依那普利、替莫普利[15,16],血管紧张素Ⅱ抑制剂奥美沙坦和缬沙坦[17,18]等),其中胆红素及其葡萄糖甘酸是OATP-C的天然底物[19],这也是OATPs家族中唯一能转运胆红素的成员。OATP-C在肝脏的特有分布及其底物的广泛性表明OATP-C在肝脏摄取药物中有极其重要的作用。因此研究其转运分子机制对于阐明药物和毒素在肝脏的摄取转运过程以及了解和认识肝脏OATP-C参与的药物代谢动力学、胆酸和胆红素摄取转运、肝脏解毒功能有重要的理论意义,对进一步设计和筛选该转运蛋白的抑制剂或增强剂用于临床治疗也具有重要的指导意义。本研究源于我们从比较生物学的角度,发现起源于2亿年前的一种古老的海洋鱼类低等脊椎动物-多髦毛小“鳐”(Raja erinacea, or Skate)的肝脏中,存在与高等哺乳动物鼠和人等相似的有机阴离子转运系统,并克隆得到了一个在其肝脏组织中特异性高表达的、原始的sOatp基因[20]。进一步对比“鳐”肝脏特异的sOatp和人肝特异性的OATP-C分子的高同源性区域,结合其有机阴离子底物转运特性,发现OATP-C分子的7个位点的阳离子氨基酸为高度保守的氨基酸(即49 lys(k)、57 arg(r)、58 arg(r)、115 his(h)、181 arg(r)、490 lys(k)、580 arg(r) )。我们推测这些阳离子氨基酸基团与OATP-C分子有机阴离子底物摄取功能密切相关,可能是关键的氨基酸基团。为验证此假说,我们从人肝脏mRNA中克隆得到OATP-C全长cDNA序列,DNA序列测定完全正确。通过定点突变技术将这些阳离子氨基酸分别突变为中性氨基酸,并构建其C端的GFP融合蛋白的真核表达载体。我们将野生型和突变体氨基酸的GFP融合真核表达质粒分别转染培养的HEK293细胞,实验观察野生型和突变体OATP-C基因的细胞膜定位能力及其底物摄取功能变化,以期揭示OATP-C转运多肽对有机阴离子底物的选择性转运的分子作用机制。材料和方法我们前期克隆的pcDNA-OATP-C -GFP野生融合型基因真核表达质粒(称野生型,Wt)及其保守区的7个阳离子氨基酸突变体融合基因真核表达质粒(称突变体,Mut1~Mut7),经过由大肠杆菌DH5α感受态进行转化、扩增以及纯化,得到较大量的质粒;然后将8个质粒分别转染入贴壁培养的HEK293细胞后,在激光共聚焦显微镜下观察HEK293细胞膜上绿色荧光的表达情况,间接了解Wt、Mut1~Mut7在HEK293细胞膜的定位能力;进一步将8个质粒转染HEK293细胞,加入等量的OATP-C的底物[3H]硫酸盐雌酮ES(Estrone sulfate),分别测定其5分钟的底物摄取量,进行Wt和Mut1~Mut7对底物ES摄取量的比较;并将Wt和膜外区Mut1、Mut6质粒分别转染HEK293细胞,加入不同浓度的[3H]ES,测定三种质粒对不同浓度ES的摄取量,计算出三者对ES的摄取动力曲线,比较三者的Km、Vmax值。结果1. Wt、Mut1~Mut7八个融合蛋白质粒均经过大肠杆菌DH5α感受态成功扩增,并用invitrogen公司的PureLinkTM Quick质粒试剂盒纯化,用分光光度计测定8个质粒的OD值,计算出其浓度。2. Wt、Mut1~Mut7八个融合蛋白质粒转染HEK293细胞后,在激光共聚焦显微镜下观察,均发现在其细胞膜上有绿色荧光表达,说明均有细胞膜定位能力;通过共聚焦显微镜对胞膜绿色荧光的灰度进行比较(p值均大于0.05),说明在转染后的HEK293细胞膜上的绿色荧光灰度未见明显差异,表明在膜上的八种融合蛋白表达量是没有明显差异的。3. Wt、Mut1~Mut7八个融合蛋白质粒转染HEK293细胞后,加入等量的[3H]硫酸盐雌酮(ES),经过3H放射量测定,换算出各自5min的对底物ES的摄取量。结果表明:Mut1~Mut7融合蛋白与Wt相比,5min的底物摄取量均明显减少,P值均<0.01。说明了7个突变体的对硫酸盐雌酮摄取功能是明显减弱的。4. Wt和膜外区Mut1、Mut6质粒转染HEK293细胞,加入不同浓度的[3H]硫酸盐雌酮,测定三种质粒对不同浓度的硫酸盐雌酮的摄取量,计算出三者的对硫酸盐雌酮摄取动力曲线:Wt:Km=0.26±0.03 ,Vmax=111.8±2.1;Mut1:Km=0.43±0.04 , Vmax=50.5±2.6;Mut6:Km=1.20±0.06,Vmax=88.7±5.9。(Km的单位为μM;Km的单位为pmol.mg.protein-1.5min-1)。Wt与Mut1比较,Km p=0.005,Vmax P=0.000;Wt与Mut6比较,Km P=0.000,Vmax P=0.003。从结果可以看出,膜外区Mut1、Mut6两种融合蛋白与Wt相比,摄取硫酸盐雌酮的Km值均增大,而Vmax值均减小,进一步从底物摄取动力学角度证明了膜外区的Mut1、Mut6对硫酸盐雌酮的摄取能力是明显减弱的。讨论OATP-C是在人肝脏组织中特异性表达的有机阴离子转运蛋白,1999年被Husang等克隆[21],含有2175个核苷酸,编码691个氨基酸,它存在于肝细胞窦状间隙膜上,是参与肝脏从血液中摄取、清除多种内源性和外源性有机溶质(如胆红素、某些药物和外源性有机阴离子等)的重要的膜蛋白[22]。越来越多的研究显示,OATP-C对药物的运输也是影响肝脏药物代谢的重要环节,有研究发现OATP-C对在肝脏转化灭活药物的代谢起着重要作用,如新型他汀类降血脂药物普伐他汀(Pravastatin) [23,24]主要经肝细胞转运摄取、排泄清除,OATP-C是其在肝细胞膜上摄入的主要转运泵,由于肝细胞对它的摄取是限速的,OATP-C的活性直接影响其摄取和血液浓度。抗结核药物Rifamycin SV和Rifampicin的临床治疗时病人常出现高胆红素血症以及溴磺酚BSP(Bromosulfophthalein)清除率降低等肝功能损害的副作用,可能与这类药物抑制OATP-C的活性而导致其毒副反应的重要机制之一[25]。有研究还发现,OATP-C参与非结合型胆红素的转运,至今尚未发现OATPs家族的其它成员具有此功能,因此其活性的减低可能与遗传性家族性非结合胆红素血症(Gilbert综合征)有关[19]。因此研究其转运分子机制对于阐明家族性黄疸的发病机制、药物和毒素在肝脏的摄取转运过程均具有重要的临床意义。本研究是基于我们从比较生物学角度比对“鳐”肝脏特异的sOatp[20]和人肝特异性的OATP-C分子的高同源性区域,结合其有机阴离子底物转运特性,发现OATP-C分子的7个位点的氨基酸为高度保守的阳离子氨基酸(即49 lys(k)、57 arg(r)、58 arg(r)、115 his(h)、181 arg(r)、490 lys(k)、580 arg(r) )。基于先期已有的对美国非洲裔和欧洲裔人群调查的研究中发现的,OATP-C基因的单个碱基突变、尤其是发生于保守区的突变可以直接严重减弱其摄取功能,另有少数突变是通过影响其在细胞内表达后的细胞膜定位而间接削弱其功能,而同源性较低的区域的突变对其功能影响很小或甚至没有影响[26]。我们推测这些高度保守的阳离子氨基酸与OATP-C分子有机阴离子底物摄取功能密切相关,可能是OATP-C分子关键的功能氨基酸基团。因此,通过定点突变将这些阳离子氨基酸突变为中性氨基酸,构建其C端的GFP融合蛋白的真核表达载体。通过转染HEK293细胞来研究突变体的细胞膜定位能力和底物摄取功能的变化。我们研究结果表明,这些阳离子氨基酸突变体在HEK293细胞膜上是有表达的,说明是有膜定位能力的,共聚焦显微镜经胞膜绿色荧光的灰度均值比较(p值均大于0.05),说明在转染后的HEK293细胞膜上的绿色荧光灰度未见明显差异,说明在HEK293细胞膜上的八种融合蛋白表达量是没有明显差异的,表明这些阳离子氨基酸突变为中性氨基酸后对在HEK293细胞膜的定位能力没有明显影响。在对OATP-C底物ES(Estrone sulfate)的5min摄取实验表明,突变体对底物硫酸盐雌酮的摄取量是明显减少的,与Wt相比,P值均<0.01。说明了突变体对硫酸盐雌酮的摄取能力是明显减弱的。这种减弱,可能是突变体由阳离子氨基酸转变为中性氨基酸后,电荷的转变影响了对底物硫酸盐雌酮的摄取能力,也有可能与突变后电荷改变影响了该蛋白的空间结构有关。我们的研究证实了这些阳离子氨基酸是OATP-C分子重要的功能氨基酸,是OATP-C分子发挥其功能重要的关键功能单位。进一步,我们研究了功能明显减弱的膜外区Mut1、Mut6对硫酸盐雌酮的摄取动力曲线,以期进一步从摄取动力学角度了解突变体对OATP-C对硫酸盐雌酮摄取功能的影响。据Wt和膜外区Mut1、Mut6的摄取动力曲线发现:Mut1、Mut6与Wt相比,Km均明显增大,而Vmax则明显减小,二者的Km和Vmax与Wt的Km和Vmax相比较,P值均<0.01。说明了Mut1、Mut6对底物硫酸盐雌酮的摄取能力是明显减弱的,因此我们推测49 lys(k)、490 lys(k)突变体对OATP-C分子的对硫酸盐雌酮的摄取能力是明显减弱的,也说明了OATP-C分子的7个位点的高度保守阳离子氨基酸(49 lys(k)、57 arg(r)、58 arg(r)、115 his(h)、181 arg(r)、490 lys(k)、580 arg(r) )与OATP-C分子对底物硫酸盐雌酮摄取功能是密切相关的,是OATP-C分子的功能氨基酸基团。结论从比较生物学的角度比对“鳐”肝脏特异的sOatp和人肝特异性的OATP-C分子的高同源性区域,结合其有机阴离子底物转运特性,发现OATP-C分子的7个位点的氨基酸为高度保守的阳离子氨基酸(即49 lys(k)、57 arg(r)、58 arg(r)、115 his(h)、181 arg(r)、490 lys(k)、580 arg(r) )。推测它们为OATP-C分子的重要功能氨基酸基团,因此通过定点突变将这些阳离子氨基酸突变为中性氨基酸,构建OATP-C分子C端的GFP融合蛋白的真核表达载体。将野生型和突变后的突变体氨基酸的GFP融合真核表达载体的质粒转染培养的HEK293细胞,实验观察野生型和突变体的细胞膜定位能力及其对底物硫酸盐雌酮摄取能力的变化,结果证实了这些保守的阳离子氨基酸与OATP-C分子对其底物硫酸盐雌酮的摄取功能密切相关,证实了7个位点的高度保守的阳离子氨基酸是OATP-C分子功能的关键氨基酸基团。

全文目录

英文缩写一览表  4-6
英文摘要  6-9
中文摘要  9-17
论文正文人肝脏特异性OATP-C分子保守区阳离子氨基酸在硫酸盐雌酮转运中的作用  17-62
  前言  17-19
  第一部分质粒Wt、Mut1～Mut7 在大肠杆菌DH_(5α)感受态的转化、扩增以及纯化  19-25
    前言  19
    材料与方法  19-24
    结果  24
    小结  24-25
  第二部分 Wt、Mut1~Mut7 在HEK293 细胞膜上的表达情况  25-38
    前言  25
    材料与方法  25-30
    结果  30-36
    讨论  36-37
    小结  37-38
  第三部分 Wt、Mut1~Mut7 转染HEK293 细胞对[~3H]硫酸盐雌酮的5 分钟摄取功能实验以及Wt 和膜外区Mut1、Mut6 对硫酸盐雌酮摄取动力曲线实验  38-57
    前言  38
    材料与方法  38-45
    结果  45-55
    讨论  55-57
  参考文献  57-59
  全文结论  59-61
  致谢  61-62
文献综述人有机阴离子转运多肽在药物分布中的作用研究进展  62-76
  参考文献  67-76
硕士研究生期间主要发表论文  76

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