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分子突变改善扩展青霉脂肪酶的耐热性

作　者: 沈麟
导　师: 林琳
学　校: 福建师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 扩展青霉脂肪酶叠加突变热稳定性
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

扩展青霉脂肪酶(PEL)可在油水界面催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油,是工业生产上一种重要的水解酶。本研究利用叠加突变技术手段,对扩展青霉脂肪酶(Penicillium expansum lipase, PEL)进行热稳定性的蛋白质工程改造。ep8是由本课题组前期获得的含有一个突变点的扩展青霉脂肪酶随机突变体,其热稳定性比野生型有所提高。作者以ep8为模板,利用重叠延伸PCR构建了pPIC3.5K-ep8-K56R、pPIC3.5K-ep8-P90D、pPIC3.5K-ep8-E207P、pPIC3.5K-ep8-E221P、pPIC3.5K-ep8-K226A、pPIC3.5K-ep8-P82D、pPIC3.5K-ep8-E113P、pPIC3.5K-ep8-I164S、pPIC3.5K-ep8-K115P、pPIC3.5K-ep8-S139R、pPIC3.5K-ep8-N157Y、pPIC3.5K-ep8-K56R-K115R等突变基因表达载体。将这些携带突变基因的表达质粒转化入毕赤酵母GS115,获得了12种含有突变基因的脂肪酶基因工程菌：PEL-ep8-K56R-GS、PEL-ep8-P90D-GS、PEL-ep8-E207P-GS、PEL-ep8-E221P-GS、PEL-ep8-K226A-GS、PEL-ep8-P82D-GS、PEL-ep8-E113P-GS、PEL-ep8-I164S-GS、PEL-ep8-K115P-GS、PEL-ep8-S139R-GS、PEL-ep8-N157Y-GS、PEL-ep8-K56R-K115R-GS。通过平板、摇瓶发酵并在甲醇的诱导下进行突变脂肪酶表达,突变脂肪酶的温度适宜性和热稳定性,结果显示：PEL-ep8-K56R、PEL-ep8-P90D、PEL-ep8-E207P、PEL-ep8-E221P、PEL-ep8-K226A、PEL-ep8-P82D、PEL-ep8-E113P、PEL-ep8-I164S、PEL-ep8-K115P、PEL-ep8-S139R、PEL-ep8-N157Y、PEL-ep8-K56R-K115R等12个叠加突变体中,(1)叠加突变体PEL-ep8-K56R的最适作用温度为37℃,比野生型脂肪酶PEL的最适作用温度下调了3℃,热稳定性(Tm)比野生型提高了1.4℃,比随机突变体PEL-ep8提高了0.2℃。发酵酶活约为852U/ml,是一个热稳定性获得一定提高的突变体。(2)叠加突变体PEL-ep8-P90D最适作用温度比野生型PEL-GS降低6℃,Tm比随机突变体PEL-ep8低0.8℃,比野生型高0.1℃；发酵酶活约为584U/mL。(3)叠加突变体PEL-ep8-K56R-K115R-GS的Tm值为37.5℃,比野生型下降了2.5℃；发酵酶活约为56U/mL。(4)叠加突变体PEL-ep8-E207P、PEL-ep8-E221P、PEL-ep8-K226A、PEL-ep8-P82D、PEL-ep8-E113P、PEL-ep8-I164S、PEL-ep8-K115P、PEL-ep8-S139R及PEL-ep8-N157Y均不能够在YPOM板上形成透明圈,SDS-PAGE分析亦无脂肪酶目的蛋白。综上,通过本研究获得了一株热稳定性有所提高的脂肪酶叠加突变体PEL-ep8-K56R,其热稳定性(Tm)比野生型提高了1.4℃,比随机突变体PEL-ep8提高了0.2℃；其发酵酶活比野生型提高了21.1%、比随机突变体提高了3.4%,为今后进行多重叠加突变体研究奠定了基础。

全文目录

摘要  2-4
Abstract  4-6
中文文摘  6-8
目录  8-10
第1章绪论  10-32
  1.1 课题背景  10-11
  1.2 酶的热稳定性  11-32
    1.2.1 概述  11-12
    1.2.2 酶热稳定性的定义  12
    1.2.3 使用热稳定性酶的益处  12-13
    1.2.4 热稳定性酶的应用  13
    1.2.5 酶的热致失活  13-14
    1.2.6 酶热稳定的影响机制  14-21
    1.2.7 如何提高蛋白质的热稳定性  21-32
第2章材料与方法  32-46
  2.1 材料  32-35
    2.1.1 菌种与载体  32
    2.1.2 工具酶  32
    2.1.3 其它试剂  32
    2.1.4 常用仪器  32
    2.1.5 常用培养基和缓冲液  32-33
    2.1.6 寡聚核苷酸引物  33-35
  2.2 实验方法  35-46
    2.2.1 重组质粒载体pSK-ep8的制备  35-36
    2.2.2 叠加突变  36-46
第3章结果与分析  46-64
  3.1 突变点的选择  46-64
    3.1.1 PEL-ep8-K56R叠加突变  48-52
    3.1.2 PEL-ep8-P90D叠加突变  52-56
    3.1.3 K56R-K115R叠加突变  56-60
    3.1.4 E207P、E221P、K226A、P82D、E113P、1164S、K115P、S139R、N157Y叠加突变  60-64
第4章总结与讨论  64-68
附录英文缩略词表  68-70
参考文献  70-76
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  76-78
致谢  78-80
个人简历  80

分子突变改善扩展青霉脂肪酶的耐热性

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