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枯草杆菌异柠檬酸脱氢酶的酶学性质研究和辅酶特异性改造

作　者: 许希晨
导　师: 朱国萍
学　校: 安徽师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 枯草杆菌异柠檬酸脱氢酶突变体酶酶学性质辅酶特异性
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase, IDH）是三羧酸循环的关键性酶,为新陈代谢提供能量和生物合成前体物质。根据辅酶特异性,异柠檬酸脱氢酶可分为NADP⁺-依赖性IDH （NADP-IDH, EC.1.1.1.42）和NAD⁺-依赖性IDH （NAD-IDH, EC.1.1.1.41）。根据亚基的组成,NADP-IDH又可以再分为两类:同源二聚体IDH和单体IDH,所有的真核生物和大部分原核生物的NADP-IDH都是同源二聚体,只有少数原核生物编码单体NADP-IDH。枯草杆菌异柠檬酸脱氢酶（Baci llus subtilis IDH, BsIDH）、大肠杆菌异柠檬酸脱氢酶（Escherichia coli IDH, EcIDH）和大肠杆菌异柠檬酸脱氢酶的突变体酶（Escherichia coli mutant IDH, EmIDH）都是二聚体IDH,它们的酶学性质尚未有系统的研究。本实验对这三种IDH进行了高效表达和亲和纯化,并对它们的酶动力学、最适反应温度、最适反应pH、金属依赖性等酶学性质进行了细致的研究,为深入认识IDH的催化机制提供了依据。酶动力学研究表明,BsIDH和EcIDH对辅酶NADP⁺的特异性与对辅酶NAD⁺的特异性相比,分别是NAD⁺的1330倍和3890倍。而EmIDH对NAD⁺的特异性与NADP⁺相比,是NADP⁺的122倍。因此BsIDH和EcIDH是NADP⁺-依赖性异柠檬酸脱氢酶,而EmIDH的辅酶特异性已转换为NAD⁺-依赖性。EcIDH、BsIDH和EmIDH对底物异柠檬酸的Km值分别为67.4μM、60.6μM和105.6μM。BsIDH和EcIDH的最适反应pH分别为8.2和8.0,EmIDH的最适pH为7.0。BsIDH和EmIDH的最适反应温度是45℃,EcIDH的最适温度为43℃。三种IDH的活性依赖于不同的二价金属离子的存在,Mn²⁺、Mg²⁺存在时酶活性最强,而Cu²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺和Ni²⁺是IDH的强烈抑制剂。为实现BsIDH辅酶特异性的转换,在将多种不同来源的IDH氨基酸序列进行同源比对后,选定BsIDH的7个氨基酸位点进行定点突变。我们共构建了T3、T5、T6、T7四种突变体,并检测和比较了突变型和野生型BsIDH的酶动力学参数。实验结果显示,BsIDH的辅酶特异性发生了由NADP⁺向NAD⁺的转变,其中T7对NAD⁺的特异性是对NADP⁺特异性的280倍。BsIDH辅酶特异性的转换证实了IDH辅酶决定性位点的保守性,也为验证IDH辅酶适应性进化机制的普遍性提供了初步依据。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-10
第一章综述  10-36
  1 异柠檬酸脱氢酶的进化  10-12
    1.1 β-脱羧脱氢酶家族及进化  10-11
    1.2 异柠檬酸脱氢酶家族的进化  11-12
  2 IDH 的空间结构  12-16
    2.1 NADP-IDH 的结构  12-15
    2.2 NAD-IDH 的结构  15-16
  3 IDH 的酶学性质  16-20
    3.1 IDH 的辅酶特异性和底物特异性  16-18
    3.2 IDH 的最适pH 和最适pH 范围  18-19
    3.3 IDH 的最适温度和热稳定性  19
    3.4 金属离子对IDH 的影响  19-20
  4 异柠檬酸脱氢酶的生物学功能  20-22
  5 枯草芽胞杆菌及枯草芽胞杆菌异柠檬酸脱氢酶  22-25
    5.1 枯草芽胞杆菌  22-23
    5.2 枯草芽胞杆菌异柠檬酸脱氢酶  23-25
  6 脱氢酶类的辅酶特异性改造  25-28
    6.1 脱氢酶的辅酶特异性改造简介  25-26
    6.2 异柠檬酸脱氢酶的辅酶特异性改造实例  26-28
  7 实验意义及展望  28
  参考文献  28-36
第二章枯草杆菌异柠檬酸脱氢酶的酶学性质分析  36-58
  1 材料与方法  37-46
    1.1 实验材料  37-39
    1.2 实验方法  39-46
  2 结果与分析  46-52
    2.1 重组质粒pET-BsIDH、pET-EcIDH 和pET-EmIDH 的构建  46-47
    2.2 蛋白质的表达与纯化  47-48
    2.3 BsIDH、EcIDH 和EmIDH 的酶学性质研究  48-52
  3 讨论  52-58
    3.1 辅酶及底物特异性  52-53
    3.2 最适反应pH  53-54
    3.3 金属离子对异柠檬酸脱氢酶活性的影响  54
    参考文献  54-58
第三章枯草杆菌异柠檬酸脱氢酶的辅酶特异性改造  58-79
  1 材料与方法  59-65
    1.1 材料  59-60
    1.2 实验方法  60-65
  2 结果与分析  65-71
    2.1 突变位点的选择  65
    2.2 含突变位点的重组质粒的构建与克隆  65-67
    2.3 突变体酶的表达和纯化  67-68
    2.4 突变体酶的活性分析  68-69
    2.5 突变体酶的动力学参数测定  69-71
  3 讨论  71-77
    3.1 与辅酶特异性有关的氨基酸位点  71-73
    3.2 突变体酶的辅酶特异性  73-76
    3.3 辅酶特异性改造的意义  76-77
  参考文献  77-79
致谢  79-80
附：本人在读研期间发表和合作的科研论文情况一览表  80

枯草杆菌异柠檬酸脱氢酶的酶学性质研究和辅酶特异性改造

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