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抗人ARMET单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

作　者: 王法财
导　师: 沈玉先
学　校: 安徽医科大学
专　业: 药理学
关键词: ARMET / MANF /ARP 单克隆抗体杂交瘤 ELISA检测方法
分类号: R446.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

ARMET (Arginine rich, mutated in early stage of tumors, ARMET)在公共数据库中也称为ARP(arginine-rich protein, ARP)或MANF (mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor, MANF),到目前为止,与ARMET相关的报道不多,其功能还不清楚。ARMET基因是从30000个基因中筛选出的对内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ER stress)最敏感的基因,有人将其表达的蛋白称为中脑星形胶质细胞来源的促神经生长因子(MANF)。但我们的研究发现,中脑星形胶质细胞不是它的主要来源,它在脑内的神经元中广泛表达,且内质网应激上调其表达。内质网应激存在于许多疾病中,ARMET作为一个分泌蛋白,可能成为血清学诊断的指标,所以快速血清学检测方法的建立将为临床相关疾病的早期辅助诊断提供及时的帮助。目的:本研究的目的是制备抗人ARMET单克隆抗体(mAb),并建立ELISA方法及相应检测试剂,为ARMET的生物学活性及功能研究提供便利条件,也为临床相关疾病的早期辅助诊断提供帮助。方法:将pET28a-ARMET转化到大肠杆菌BL21中,然后用IPTG诱导表达,用预装好的Ni-beads柱进行纯化,通过SDS-PAGE电泳及考玛斯亮蓝染色方法判断融合蛋白的表达量及纯度。将纯化的ARMET免疫雌性BALB/c小鼠后采用淋巴细胞杂交瘤技术,获取分泌抗ARMET杂交瘤细胞株。体内诱生腹水法制备mAb,间接ELISA法测定其效价及抗体亚型,辛酸-硫酸铵沉淀法及亲和层析法纯化mAb。用免疫荧光双标及western blot法对抗体的特异性进行了鉴定。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法制备检测试剂盒。将克隆2G4产生的单克隆抗体稀释为系列不同浓度后包被ELISA板,洗涤后加入稀释成一定浓度的ARMET蛋白,同时设立空白对照,洗涤后加入兔抗ARMET多克隆抗体孵育,再加入HRP标记的抗兔抗体,最后用酶标仪测量OD450nm值。检测正常雌雄大鼠、脑缺血大鼠、关节炎大鼠、关节炎兔及人外周血中的ARMET水平。结果:1.蛋白质的表达与纯化ARMET蛋白在大肠杆菌中的表达产物以可溶性形式存在。实验获得了纯度较高、浓度较高的融合蛋白。2.抗ARMET单克隆抗体的制备及特异性研究建立了7株稳定分泌特异性抗ARMET单克隆抗体的杂交瘤细胞株,诱生腹水法获得的抗体效价在1×10–5~1×10-7之间,且均有较好的特异性,纯化后的抗体效价不变且纯度较高。3.检测ARMET的ELISA方法的建立双抗体夹心ELISA法检测ARMET的最小检出限为5 ng/ml,标准曲线在5ng/ml ~100 ng/ml范围内线性良好。4.正常雌、雄大鼠血清中ARMET水平的检测SPF级雄性正常SD大鼠血清中ARMET测量值为1.25μg/ml~2.3μg/ml,平均值为(1.67±0.46)μg/ml(n=5)。SPF级雌性正常SD大鼠血清中ARMET测量值为3.18μg/ml~5.08μg/ml,平均值为(4.22±0.77)μg/ml(n=5)。SPF级正常SD大鼠SPF级实验室现场取血,外周血中未检测到ARMET。5.脑缺血大鼠外周血中ARMET的水平大鼠脑缺血实验中使用的是普通级雄性SD大鼠,假手术组中大鼠血清中ARMET测量值为0.4μg/ml~2.8μg/ml,平均值为(1.66±1.01)μg/ml(n=4);手术组中大鼠血清中ARMET测量值为0.23μg/ml~3.91μg/ml,平均值为(1.74±0.93)μg/ml(n=15)。6.关节炎大鼠外周血中ARMET的水平大鼠关节炎实验中使用的是普通级雄性SD大鼠,在致炎后的第2d、第7d、第14d、第21d、第28d测量血清中的ARMET水平。致炎后第2d大鼠血清中ARMET测量值为0.5μg/ml~1.2μg/ml,平均值为(1.02±0.39)μg/ml(n=4);致炎后第7d大鼠血清中ARMET测量值为0.7μg/ml~1.8μg/ml,平均值为(1.2±0.42)μg/ml(n=6);致炎后第14d大鼠血清中ARMET测量值为1.49μg/ml~2.42μg/ml,平均值为(1.92±0.41)μg/ml(n=6);致炎后第21d大鼠血清中ARMET测量值为0.7μg/ml~2.05μg/ml,平均值为(1.25±0.53)μg/ml(n=6);致炎后第28d大鼠血清中ARMET测量值为0.6μg/ml~1.70μg/ml,平均值为(1.16±0.41)μg/ml(n=6)。7.关节炎兔外周血中ARMET的水平兔关节炎实验中,正常组雌性新西兰白兔血清中ARMET水平为1.67μg/ml~5.78μg/ml,平均值为(4.21±2.21)μg/ml(n=3);模型组新西兰白兔血清中ARMET测量值为178μg/ml~621μg/ml,平均值为(319.46±197)μg/m(ln=5);地塞米松治疗组新西兰白兔血清中ARMET测量值为134μg/ml~554μg/ml,平均值为(272.3±190)μg/ml(n=5);氯化钆治疗组新西兰白兔血清中ARMET测量值为87μg/ml~550μg/ml,平均值为(206.45±179.39)μg/ml(n=5)。8.人外周血中ARMET的水平成年男女正常血清中未检测到ARMET(男20名,女20名),100例肿瘤患者血清中未检测到ARMET。结论已成功制备特异性较高的抗人ARMET单克隆抗体及ELISA检测试剂盒,后者可测范围广,灵敏度和精密度均较高。

抗人ARMET单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

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