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抗鸡SIgA单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

作　者: 王文强
导　师: 龙塔；王选年
学　校: 河南科技大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 鸡 胆汁 分泌型免疫球蛋白A 杂交瘤 单克隆抗体
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


家禽黏膜免疫作为动物机体抵抗病原感染的第一道免疫屏障有着重要的意义。分泌型免疫球蛋白A(SIgA)做为黏膜免疫的效应因子,对病原菌在黏膜表面黏附、增殖,启动免疫学生物活性,清除病原及保护机体抗感染等方面发挥重要作用。杂交瘤技术,是20世纪70年代到80年代诞生的生物高新技术,应用免疫学的抗体产生原理和细胞杂交技术,获得单一抗原决定簇的高度均一的相应抗体,该种抗体特异性好,敏感性高,来源稳定,容易标准化,与多克隆抗体相比,具有显著的特点。本研究首次以新鲜的鸡胆汁为材料,采用硫酸铵盐析法从鸡胆汁中粗提纯鸡SIgA,应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳鉴定和纯化SIgA重链,再用纯化的鸡SIgA重链蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分混合颈背部皮下多点注射8周龄雌性Balb/c小鼠,SIgA 50μg/只,隔2周后用弗氏不完全佐剂与之混合,共免疫2次,超强免疫纯抗原以100μg/只尾静脉和腹腔注射。3d后取小鼠脾细胞与NS0骨髓瘤细胞,在聚乙二醇(PEG-1500)作用下进行细胞融合,当融合细胞长满细胞培养板时,用间接ELISA进行阳性杂交瘤的筛选,通过有限稀释法3次克隆后,筛选出1株能够稳定分泌抗鸡SIgA单克隆抗体的杂交瘤细胞株5H9。经间接ELISA检测验证,其细胞培养上清和腹水效价为1:400-1:800,1:16000,表明所获得的单克隆抗体具有和SIgA高度亲和力和特异性。6个月内连续冻存和复苏3次,并连续传代10次后,抗鸡SIgA杂交瘤细胞株仍能稳定分泌抗体,并制备出抗鸡SIgA单克隆抗体,为进一步研究家禽黏膜免疫机制和鸡传染性疾病的早期诊断与防治提供了重要的技术基础。

全文目录


摘要  2-3
ABSTRACT  3-8
第1章 文献综述  8-23
  1.1 免疫球蛋白概况  8-12
    1.1.1 Ig 的发现及命名  8
    1.1.2 Ig 的结构  8
    1.1.3 Ig 的基本机构  8-9
    1.1.4 Ig 的其它结构  9
    1.1.5 Ig 的分类  9-10
    1.1.6 Ig 的性质  10-11
    1.1.7 Ig 的生物学功能  11-12
  1.2 家禽黏膜免疫系统  12-17
    1.2.1 家禽黏膜免疫系统的构成  12-13
    1.2.2 家禽黏膜诱导部位和效应部位的免疫细胞  13-15
    1.2.3 家禽黏膜免疫系统的特点  15-16
    1.2.4 鸡黏膜免疫的基本过程  16
    1.2.5 黏膜免疫的功能  16-17
  1.3 黏膜免疫效应因子-SIgA  17-21
    1.3.1 SIgA 的结构  17
    1.3.2 SIgA 的产生及其转运  17-18
    1.3.3 SIgA 的调节  18
    1.3.4 SIgA 的生物学功能  18-19
    1.3.5 SIgA 与黏膜免疫反应  19-20
    1.3.6 黏膜免疫系统的应用  20-21
  1.4 单克隆抗体在畜禽中的应用研究进展  21-22
    1.4.1 单克隆抗体的特点及研究状况  21
    1.4.2 单克隆抗体在疾病诊断方面的应用  21-22
    1.4.3 单克隆抗体在疾病治疗方面的应用  22
  1.5 论文主要研究内容及目的意义  22-23
第2章 鸡 SIgA 的粗提、纯化及鉴定  23-28
  2.1 材料  23-24
    2.1.1 试验材料与设备  23
    2.1.2 主要的溶液系统  23-24
  2.2 方法  24-25
    2.2.1 SIgA 的粗提纯  24
    2.2.2 SIgA 的纯化  24
    2.2.3 蛋白质含量测定  24-25
    2.2.4 SDS-PAGE 电泳鉴定  25
  2.3 结果与分析  25-26
    2.3.1 SIgA 粗提物和纯化后SIgA 的蛋白含量  25
    2.3.2 SIgA 粗提物和SIgA 纯化后的SDS-PAGE 电泳  25-26
  2.4 讨论  26-28
第3章 小鼠免疫及间接 ELISA 方法的建立  28-35
  3.1 材料  28-29
    3.1.1 试验动物  28
    3.1.2 主要试剂  28
    3.1.3 主要溶液的系统  28-29
  3.2 方法  29-30
    3.2.1 小鼠免疫  29
    3.2.2 小鼠血清效价的测定  29
    3.2.3 测定酶标二抗的最佳工作浓度  29-30
    3.2.4 测定小鼠阳性血清的最佳工作浓度  30
    3.2.5 测定SIgA 抗原的最佳工作浓度  30
  3.3 结果与分析  30-32
    3.3.1 免疫小鼠血清抗体的效价  30-31
    3.3.2 酶标二抗的工作浓度  31
    3.3.3 抗原包被最佳浓度与阴、阳性血清最佳稀释度的确定  31-32
  3.4 讨论  32-35
    3.4.1 小鼠免疫  32-33
    3.4.2 间接ELISA 方法的建立  33-35
第4章 抗鸡 SIgA 单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立  35-50
  4.1 材料  35-36
    4.1.1 试验动物与细胞  35
    4.1.2 主要试剂及药品  35
    4.1.3 仪器设备  35-36
    4.1.4 液体的配制  36
  4.2 方法  36-41
    4.2.1 杂交瘤细胞株的建立  36-40
    4.2.2 单克隆抗体的制备  40
    4.2.3 单克隆抗体的鉴定  40-41
  4.3 结果与分析  41-44
    4.3.1 融合结果  41
    4.3.2 杂交瘤细胞的形态观察  41-43
    4.3.3 阳性杂交瘤的建立  43
    4.3.4 单克隆抗体的鉴定  43-44
  4.4 讨论  44-50
    4.4.1 融合前的超强免疫  45
    4.4.2 细胞融合及培养  45-46
    4.4.3 阳性杂交瘤细胞的筛选及克隆  46-47
    4.4.4 杂交瘤细胞的不生长  47-48
    4.4.5 杂交瘤细胞的冻存  48
    4.4.6 单克隆抗体制备方法  48
    4.4.7 关于试验中污染问题的解决  48-50
第5章 结论  50-51
参考文献  51-59
致谢  59-60
攻读硕士学位期间的研究成果  60

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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