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乙型脑炎病毒单克隆抗体的制备与初步应用

作　者: 裴国顺
导　师: 侯兰新
学　校: 西北民族大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 乙型脑炎病毒单克隆抗体双抗体夹心ELISA 制备应用
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

乙型脑炎又称日本脑炎(Japanese Encephalitis,JE),是由乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)引起的一种重要蚊媒性人兽共患传染病。猪是JEV主要的储存宿主。乙型脑炎可严重影响仔猪的存活率、出栏猪的育肥及种猪产仔,给养猪业带来巨大的经济损失。同时,JE也严重威胁人类的健康。因此,探索诊断和治疗乙型脑炎的方法对控制乙型脑炎病毒的传播具有重要的意义。本研究利用BHK-21细胞增殖乙型脑炎SA-14-14-2病毒株,纯化后免疫Balb/c鼠,取鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,经间接ELISA筛选和有限稀释法进行3次克隆,最终获得了2株分泌抗JEV单克隆抗体的细胞株,命名为B10和C4。对单克隆抗体进行亚型分析、效价测定、亲和力分析、交叉实验以及对B10、C4进行核型分析和分泌抗体的稳定性分析。结果显示:B10和C4分泌的单抗都为lgG1型;B10分泌的单抗效价为1:10万,C4分泌的单抗效价为1:24万;C4单抗亲和力比B10单抗高;交叉反应表明两株细胞分泌的抗体特异性较强;连续传代的杂交瘤细胞和冷冻后复苏的杂交瘤细胞均能稳定分泌抗体;B10和C4杂交瘤细胞的染色体数介于90-100之间。单克隆抗体经纯化后,建立双抗体夹心ELISA,用于检测筛选出的JEV阳性血清,实验结果表明该法具有良好的敏感性,能用于JEV检测,为JEV检测提供了一种备选手段,具有良好的应用前景。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-14
第一章文献综述  14-26
  1.1 乙型脑炎病毒研究进  14-17
    1.1.1 乙型脑炎流行概况及危害  14
    1.1.2 病原特性  14-15
    1.1.3 乙型脑炎病毒血清型和基因型  15
    1.1.4 乙型脑炎病毒的分子生物学特征  15-17
  1.2 乙型脑炎诊断技术研究进展  17-22
    1.2.1 血清学检测方法  17-19
    1.2.2 分离培养法  19
    1.2.3 免疫学方法  19-20
    1.2.4 分子生物学检测方法  20-22
    1.2.5 物理学方法  22
  1.3 JEV单克隆抗体研究及应用进展  22-26
    1.3.1 单克隆抗体研究进展  22-25
    1.3.2 单克隆抗体的应用  25-26
  1.4 本项目研究的目的与意义  26
第二章抗原纯化  26-34
  2.1 材料和仪器  26-27
    2.1.1 乙型脑炎病毒  26
    2.1.2 BHK-21 细胞  26
    2.1.3 主要试剂  26-27
    2.1.4 主要仪器  27
    2.1.5 主要试剂及培养基的配制  27
  2.2 实验方法  27-31
    2.2.1 抗原增殖、纯化  27-29
      2.2.1.1 病毒增殖培养  27-28
      2.2.1.2 浓缩JEV 病毒  28
      2.2.1.3 葡聚糖凝胶层析  28-29
    2.2.2 抗原检测  29-31
    2.2.3 抗原含量测定  31
  2.3 结果  31-33
    2.3.1 抗原纯化  31
    2.3.2 抗原检测  31-32
    2.3.3 抗原含量测定  32-33
  2.4 分析讨论  33
    2.4.1 制备单克隆抗体对抗原的要求  33
    2.4.2 病毒增殖  33
    2.4.3 抗原纯化  33
    2.4.4 引物设计与PCR 扩增  33
  2.5 小结  33-34
第三章乙型脑炎病毒单克隆抗体的制备  34-45
  3.1 材料和仪器  34-37
    3.1.1 实验动物  34
    3.1.2 SP2/0 细胞及其他实验用病毒  34
    3.1.3 主要仪器  34-35
    3.1.4 主要化学试剂  35
    3.1.5 主要试剂的配制  35-37
  3.2 实验方法  37-41
    3.2.1 实验动物处理  37
    3.2.2 间接ELISA 的建立  37
    3.2.3 动物免疫  37-38
    3.2.4 SP2/0 细胞的准备  38
    3.2.5 饲养细胞的制备  38
    3.2.6 SP2/0 细胞悬液制备  38-39
    3.2.7 脾细胞悬液制备  39
    3.2.8 细胞融合  39
    3.2.9 阳性克隆的筛选  39-40
    3.2.10 杂交瘤细胞的克隆化  40
    3.2.11 杂交瘤细胞冻存  40-41
    3.2.12 制备腹水  41
  3.3 结果  41-44
    3.3.1 间接ELISA 的建立  41
    3.3.2 免疫小鼠血清效价  41-42
    3.3.3 SP2/0 细胞和饲养细胞  42
    3.3.4 杂交瘤细胞株的建立  42-43
    3.3.5 腹水收集  43-44
  3.4 分析讨论  44-45
    3.4.1 动物免疫  44
    3.4.2 影响单克隆抗体制备成功的因素  44-45
    3.4.3 饲养细胞对细胞融合成功的影响  45
  3.5 小结  45
第四章乙型脑炎病毒单克隆抗体生物学特性分析与初步应用  45-54
  4.1 材料和仪器  45-46
    4.1.1 血液样本  45
    4.1.2 主要生化试剂  45
    4.1.3 主要试剂的配制  45-46
    4.1.4 主要仪器  46
  4.2 实验方法  46-50
    4.2.1 生物学特性分析  46-49
      4.2.1.1 亚型分析  46-47
      4.2.1.2 核型分析  47
      4.2.1.3 腹水及杂交瘤细胞上清纯化  47-48
      4.2.1.4 腹水抗体浓度测定  48
      4.2.1.5 单克隆抗体效价测定  48
      4.2.1.6 杂交瘤细胞分泌抗体稳定性分析  48-49
      4.2.1.7 单克隆抗体特异性分析  49
      4.2.1.8 单抗亲和力分析  49
    4.2.2 乙型脑炎病毒单克隆抗体的初步应用  49-50
      4.2.2.1 抗JEV McAb- HRP 的制备  49-50
      4.2.2.2 双抗体夹心酶联免疫吸附试验( ELISA)的建立  50
      4.2.2.3 抗原检测  50
      4.2.2.4 JEV-1、JEV-2 抗原决定簇的初步分析  50
  4.3 结果  50-53
  4.4 分析讨论  53-54
    4.4.1 核型分析与亚型分析  53-54
    4.4.2 效价分析  54
    4.4.3 JEV-1，JEV-2 抗原决定簇的分析  54
    4.4.4 单克隆抗体应用过程中存在的问题  54
  4.5 小结  54
全文结论  54-55
参考文献  55-60
作者简介  60-61
缩略词表  61-62
致谢  62

乙型脑炎病毒单克隆抗体的制备与初步应用

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