学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

绿脓杆菌SecA ATPase抑制剂筛选模型的建立和应用

作　者: 王宇
导　师: 余利岩
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 绿脓杆菌 SecA蛋白抑制剂筛选酶活
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 75次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

绿脓杆菌是一种重要的院内感染条件致病菌。它可以引起多种类型的感染,并多为天然耐多种抗生素菌株,感染后不易被控制。近年来,由于广谱抗生素的大量使用以及药物的联合治疗,导致了多药耐药株以及泛耐药株的急速出现。因此,迫切需要发现新型低毒、高效抗绿脓杆菌药物。Sec (secretion pathway)途径是细胞蛋白质转运中的主要途径,SecA是Sec途径中唯一已知的能量转化酶,可通过水解循环驱使蛋白质前体穿过细菌内膜,是细菌所独有且不可缺少的。因此,本研究选择SecA为药物的靶点并建立相应的药物筛选模型,以期发现新型高效低毒的抗绿脓杆菌药物。本研究首先克隆和表达了PaSecAN68(绿脓杆菌SecA蛋白N端609个氨基酸残基组成的片段,大小约68kDa)和PaSecAN75(绿脓杆菌SecA蛋白N端645个氨基酸残基组成的片段,大小约75kDa)蛋白并研究其酶学性质。选择酶活较高的PaSecAN75作为靶酶,建立和优化了两种绿脓杆菌SecA ATPase抑制剂酶水平筛选模型。采用孔雀绿比色法筛选了3220个化合物样品,得到4个阳性样品；采用NADH比色法筛选了7196个发酵液样品,得到66个阳性样品。随后,又运用细胞水平绿脓杆菌SecA ATPase筛选模型,对上述阳性样品进行了复筛,最终确定了3个阳性化合物样品和6个阳性发酵液样品,这些样品在酶水平和细胞水平对绿脓杆菌SecA ATPase均有较好的抑制作用,为进一步发展新型抗绿脓杆菌药物奠定了基础。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-8
缩略语表  8-9
前言  9-11
实验材料  11-18
  一、菌株  11
  二、质粒  11
  三、培养基  11-13
  四、主要试剂和试剂盒  13-14
  五、主要溶液的配制  14-16
  六、分离介质  16
  七、主要仪器  16-18
实验方法  18-36
  一、pET20b/pasecAN68,pET30a/pasecAN75质粒的构建  18-22
  二、重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达  22-25
  三、目的蛋白的纯化  25-27
  四、酶活性检测  27-29
  五、绿脓杆菌SecAATPase抑制剂酶水平筛选模型的建立和应用  29-34
  六、绿脓杆菌SecAATPase抑制剂细胞水平筛选模型的应用  34-35
  七、化合物阳性样品对PaSecAN75酶活抑制作用量效关系初探  35
  八、发酵液阳性样品中活性组分的初步分析  35-36
实验结果  36-57
  一、原核表达载体的构建  36-37
  二、绿脓杆菌PaSecAN68和PaSecAN75蛋白的表达  37-40
  三、重组蛋白的纯化  40-42
  四、PaSecA全酶、PaSecAN68、PaSecAN75的酶活性比较  42-43
  五、针对化合物样品酶水平筛选模型的建立与应用——孔雀绿比色法  43-46
  六、针对发酵液样品酶水平筛选模型的建立与应用——NADH比色法  46-53
  七、绿脓杆菌SecAATPase抑制剂细胞水平筛选模型的复筛结果  53-54
  八、活性化合物样品对PaSecAN75酶活抑制作用量效关系的初探  54-55
  九、发酵液阳性样品中活性组分的初步分析  55-57
讨论  57-60
结论  60-61
参考文献  61-63
文献综述  63-80
致谢  80

绿脓杆菌SecA ATPase抑制剂筛选模型的建立和应用

内容摘要

全文目录

相似论文