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酒酒球菌液氮超低温保存研究

作　者: 杜立业
导　师: 王华；李华
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 发酵工程
关键词: 酒酒球菌液氮超低温保存冷冻存活率模拟酒发酵酶活
分类号: TS261.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目前,已成功采用液氮超低温保存法对多种微生物进行了长期保存,如:藻类、原生动物、酵母菌、乳酸菌、铁细菌、硫细菌等。但关于酒酒球菌液氮超低温保存的研究还很少。本文通过研究酒酒球菌生长时间、冷冻方法、解冻温度、菌密度以及保护剂等对酒酒球菌细胞冷冻存活率的影响,建立最优的酒酒球菌液氮超低温保存方法。此外,还对液氮超低温保存前后酒酒球菌生长性能、酿酒特性和酶活性的变化进行了比较。主要结果如下:1.酒酒球菌液氮超低温保存条件首先在稳定期前期离心收集菌体;再加入保护剂（20g/L酵母浸提物,40V/V甘油,20g/L蔗糖,30g/L谷氨酸钠）稀释菌体,使菌密度为10⁹CFU/mL;然后直接投入液氮冷冻;最后在37℃温水浴中迅速解冻。2.保存时间对酒酒球菌细胞冷冻存活率的影响保存8个月后,酒酒球菌细胞冷冻存活率仍很高,其中22株酒酒球菌的存活率高于98%,sx-1b的细胞存活率也达到了97.1%,初步证明此法可用于酒酒球菌的长期保存。然而使用甘油保存法保存酒酒球菌8个月后的最低存活率为11.9%,最高存活率也只有26.9%。3.液氮超低温保存对酒酒球菌生长的影响液氮保存前后酒酒球菌的生长差异不明显,液氮保存后酒酒球菌的生长速率比保存前的生长速率略有提高。pH随着菌的生长不断降低,最低pH达到3.3左右。液氮保存后,酒酒球菌对培养基pH变化的影响也不显著,将液氮保存后的酒酒球菌接种于ATB培养基中,其pH降低比保存前稍快。液氮超低温保存前,SD-2a在ATB培养基中培养12、36、60、84h的OD值和pH值分别为0.100,4.8;1.459,3.85;2.180,3.49;2.240,3.31。液氮超低温保存后SD-2a在ATB培养基中培养12、36、60、84h后的OD值和pH值分别为0.150,4.79;1.573,3.77;2.180,3.41;2.240,3.30。4.液氮超低温保存对酒酒球菌苹果酸分解能力的影响液氮超低温保存后,23株酒酒球菌均保持了原有的酿酒活性。酒酒球菌SD-2a在液氮超低温保存前后的苹果酸分解量分别为1.74和1.75;31-DH在液氮超低温保存前后的苹果酸分解量分别为1.36和1.66;其它菌株的苹果酸分解量差异也不大。5.液氮超低温保存对酒酒球菌酶活性的影响液氮超低温保存前后酒酒球菌MLE和ATPase活性变化不显著,菌体仍保持着原来的活性。液氮超低温保存前,SD-2a在对数期前期、对数期中期、稳定期前期和稳定期中期的MLE活性分别为60.00、170.00、249.00、158.00μmol.malate.h^-1mg^-1protein。保存后,SD-2a在对数期前期、对数期中期、稳定期前期和稳定期中期的MLE活性分别为55.00、171.00、251.00、156.00μmol.malate.h^-1mg^-1protein。液氮超低温保存前,SD-2a在对数期前期、对数期中期、稳定期前期和稳定期中期的ATPase活性值分别为4.25、12.24、18.21、10.49μmol.Pi.h-lmg-lprotein。保存后,酒酒球菌SD-2a在对数期前期、对数期中期、稳定期前期和稳定期中期的ATPase活性值分别为4.13、12.63、17.94、10.95μmol.Pi.h-lmg-lprotein。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-12
第一章文献综述  12-24
  1.1 微生物菌种保藏原理和方法  12-14
    1.1.1 微生物菌种保藏的基本原理  12-13
    1.1.2 微生物菌种的保藏方法  13-14
  1.2 液氮超低温保藏  14-18
    1.2.1 液氮超低温保存原理  14-15
      1.2.1.1 冷冻过程中细胞受损伤的两因素假说  14-15
      1.2.1.2 溶液玻璃化理论  15
    1.2.2 冷冻保存方法  15-16
      1.2.2.1 一步冷冻法  15
      1.2.2.2 两步冷冻法  15-16
      1.2.2.3 逐级冷冻法  16
    1.2.3 液氮超低温保存的影响因素  16-18
      1.2.3.1 菌体细胞  16
      1.2.3.2 保护剂  16-17
      1.2.3.3 降温速度  17-18
      1.2.3.4 解冻方法  18
  1.3 微生物超低温保存研究进展  18-21
    1.3.1 乳酸菌液氮超低温保存研究  19
    1.3.2 酵母菌液氮超低温保存研究  19-20
    1.3.3 微型藻类液氮超低温保存研究  20-21
    1.3.4 原生动物液氮超低温保存研究  21
  1.4 液氮超低温保存发展前景  21-22
  1.5 本研究的目的和意义  22-23
  1.6 技术路线  23-24
第二章材料与方法  24-28
  2.1 试验材料  24-25
    2.1.1 试验菌株  24
    2.1.2 试剂  24
    2.1.3 仪器  24-25
  2.2 试验方法  25-28
    2.2.1 培养基的制备  25
    2.2.2 模拟酒培养液的配制  25
    2.2.3 酒酒球菌液氮超低温保存方法的优化  25-26
      2.2.3.1 菌生长时间对冷冻存活率的影响  25
      2.2.3.2 冷冻程序对冷冻存活率的影响  25
      2.2.3.3 解冻温度对冷冻存活率的影响  25
      2.2.3.4 菌密度对冷冻存活率的影响  25-26
    2.2.4 酒酒球菌液氮超低温保存法保护剂的选择  26
      2.2.4.1 单一保护剂对酒酒球菌液氮超低温保存存活率的影响  26
      2.2.4.2 酒酒球菌液氮超低温保存复合保护剂优化设计  26
      2.2.4.3 酒酒球菌保藏试验  26
    2.2.5 酒酒球菌甘油保存法  26
    2.2.6 生理生化性能测定  26-28
      2.2.6.1 液氮超低温保存前后生长曲线的测定  26
      2.2.6.2 模拟酒培养液中的接种发酵试验  26-27
      2.2.6.3 细胞内苹果酸-乳酸酶(MLE)活性的测定  27
      2.2.6.4 H~+-ATPase 活性的测定  27-28
第三章结果与分析  28-41
  3.1 液氮超低温保存条件对细胞冷冻存活率的影响  28-32
    3.1.1 生长时间对酒酒球菌SD-2a 冷冻存活率的影响  28
    3.1.2 冷冻方法对酒酒球菌SD-2a 冷冻存活率的影响  28
    3.1.3 解冻温度对酒酒球菌SD-2a 冷冻存活率的影响  28-29
    3.1.4 菌密度对酒酒球菌SD-2a 冷冻存活率的影响  29-30
    3.1.5 酒酒球菌液氮超低温保存保护剂的选择  30-32
      3.1.5.1 单一保护剂对酒酒球菌液氮超低温保存存活率的影响  30-31
      3.1.5.2 酒酒球菌液氮超低温保存复合保护剂优化设计  31-32
  3.2 保存时间对细胞冷冻存活率的影响  32
    3.2.1 酒酒球菌液氮超低温保存  32
    3.2.2 酒酒球菌甘油保存  32
  3.3 液氮超低温保存对酒酒球菌生长的影响  32-36
  3.4 液氮超低温保存对酒酒球菌酿酒特性的影响  36-39
  3.5 液氮超低温保存对酒酒球菌酶活性的影响  39-41
    3.5.1 液氮超低温保存对酒酒球菌MLE 酶活性的影响  39-40
    3.5.2 液氮超低温保存对酒酒球菌 ATPase 活性的影响  40-41
第四章讨论  41-45
  4.1 液氮超低温保存条件对酒酒球菌冷冻存活率的影响  41-42
  4.2 液氮超低温保存对酒酒球菌生长特性的影响  42-43
  4.3 液氮超低温保存对酒酒球菌酿酒特性的影响  43
  4.4 液氮超低温保存对酒酒球菌酶活性的影响  43-45
第五章结论、创新点与展望  45-47
  5.1 结论  45-46
  5.2 本实验的创新点  46
  5.3 展望  46-47
参考文献  47-52
致谢  52-53
作者简介  53
发表论文情况  53

酒酒球菌液氮超低温保存研究

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