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血红蛋白对于细菌刺激大鼠全血中性粒细胞产生生物学反应的影响

作　者: 李媛
导　师: 但宁
学　校: 西北大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 血红蛋白类氧载体聚合血红蛋白大鼠中性粒细胞绿脓杆菌活性氧物质非特异性免疫系统
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

血红蛋白类氧载体由于其独特的氧结合特性和正常的生理代谢途径等优点成为近年来血液代用品方面研究的重点,鉴于猪血红蛋白具有较高相似性及稳定性,是一种吸引力很强HBOCs规模生产原料选择的对象。随着HBOCs产品研究的不断深入,对于HBOCs产品的安全性及有效性的研究就显得尤为重要,近年来对于HBOCs产品的有效性研究已证明其良好的载氧释氧能力,但许多产品在临床研究期间出现了严重的不良反应,在一定程度上限制了HBOCs的进一步发展,因此对HBOCs产品安全性的研究就显得尤为重要。中性粒细胞是生物体非特异性免疫系统中十分重要的组成部分,目前普遍认为中性粒细胞是通过吞噬、灭活、消化等作用起到对外来物质的杀伤与消灭功能。我们近期通过对中性粒细胞呼吸爆发的研究发现,中性粒细胞在受到细菌刺激后,先后产生两个相互分离的ROS峰,其中峰Ⅰ的ROS产量较小,持续时间较短且耗氧量大;峰Ⅱ的ROS产量大,持续时间长但无明显耗氧。通过中性粒细胞的杀菌实验发现,中性粒细胞可在短时间内（5min内）灭活大量细菌,但吞噬细菌的中性粒细胞数量比率是随时间延长而增加的,由此我们将中性粒细胞分为两大类:易被外来物质激活、吞噬和/或消化活性伴随明显耗氧的早期反应中性粒细胞和激活缓慢、吞噬和/或消化活性不伴随耗氧现象的迟缓反应中性粒细胞。本文在以上研究成果的基础下,着重讨论了血红蛋白对细菌刺激大鼠全血中性粒细胞产生生物学反应的影响。主要采用化学发光等检测方法研究系统活性氧物质生成的变化,用细菌培养方法研究中性粒细胞抑菌杀菌机制,采用细胞培养、染色、光学显微镜形态学方法研究测定中性粒细胞吞噬功能。本文首先建立了稳定的化学发光反应系统,在最终确定反应条件下,Luminol-H₂O₂-HRP化学发光反应系统可在6min左右达到峰值,且峰值均在40万光子数左右。之后在该化学发光反应系统下研究了细菌刺激大鼠全血反应系统中的各种因素对化学发光反应的影响,实验结果得出,肝素、MEM及血红蛋白均可不同程度的增强化学发光反应。但在细菌刺激大鼠全血化学发光系统中,无论单体血红蛋白还是聚合血红蛋白,血红蛋白的影响作用同在化学发光系统中的完全不同。随着血红蛋白浓度的增加,对化学系统的增强作用加大,对细胞系统中峰Ⅱ的抑制作用加大。排除其他可能影响因子,我们将血红蛋白抑制细菌刺激大鼠全血化学发光的作用点定位到中性粒细胞,即迟缓反应中性粒细胞。并且推测血红蛋白通过某种胞外机制影响中性粒细胞的ROS生成量。同时我们发现,血红蛋白的加入可增强大鼠全血对于细菌的杀灭效率,但这种增强作用并不是通过增加吞噬作用达到的,因此我们可以认为,血红蛋白的加入可增强血液中中性粒细胞对细菌的敏感性,并通过某种胞外机制达到对于细菌杀伤作用。综上所述,本文在生理条件下研究了血红蛋白对于大鼠中性粒细胞产生ROS反应及对其杀菌功能的影响,研究结果对于血红蛋白本身的特性及其作为HBOCs的安全性的考察方面都提供了比较直观、可靠且新颖的检测手段和研究视角,为该产品的应用提供了新的思路。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-11
缩略语表  11-12
第一章文献综述  12-35
  1 血红蛋白类氧载体(hemoglobin based oxygen carriers)HBOCs的研究进展  12-17
    1.1 聚合血红蛋白  13-14
    1.2 HBOCs毒性及其副作用  14-17
      1.2.1 血管收缩  15-16
      1.2.2 体内代谢特点  16
      1.2.3 免疫原性  16
      1.2.4 自由基的释放  16-17
  2 非特异性免疫及中性粒细胞的杀菌机制  17-26
    2.1 非特异性免疫  17-18
      2.1.1 屏障结构  17-18
      2.1.2 吞噬细胞  18
      2.1.3 组织和体液中的抗微生物物质  18
    2.2 中性粒细胞及其杀菌机理  18-24
      2.2.1 中性粒细胞概述  18-21
      2.2.2 中性粒细胞杀菌机理  21-24
    2.3 呼吸爆发产生的机制  24-26
      2.3.1 NADPH氧化酶的活化  24-25
      2.3.2 NADPH氧化酶的组装  25-26
  3 化学发光及活性氧物质的检测方法  26-34
    3.1 化学发光与生物发光  26-30
      3.1.2 化学发光的应用  28-30
        3.1.2.1 化学发光在核酸杂交分析中的应用  28-29
        3.1.2.2 化学发光在蛋白质分析中的应用  29
        3.1.2.3 化学发光与高效液相及毛细管电泳技术  29
        3.1.2.4 细胞学检测中的应用  29
        3.1.2.5 化学发光在生物体内活性氧测定中的应用  29-30
        3.1.2.6 化学发光在被刺激的吞噬细胞中的应用  30
    3.2 活性氧物质的产生、测定方法及作用  30-34
      3.2.1 活性氧物质的产生  30
      3.2.2 活性氧物质的测定方法  30-34
  4 论文的出发点和主要工作  34-35
第二章实验部分  35-60
  1 材料  36-37
    1.1 主要试剂  36
    1.2 仪器  36
    1.3 主要溶液配方  36-37
      1.3.1 MEM的配制  36
      1.3.2 50 mM HEPES(pH7.4)缓冲液的配制  36-37
      1.3.3 Borate buffer的配制  37
      1.3.4 鲁米诺的配制  37
      1.3.5 辣根过氧化物酶的配制  37
      1.3.6 LB液体培养基的配制  37
      1.3.7 LB固体培养基的配制  37
  2 方法  37-41
    2.1 细菌菌液的制备  37-38
      2.1.1 细菌的培养  37
      2.1.2 菌液的制备  37-38
    2.2 猪血红蛋白的纯化及戊二醛聚合猪血红蛋白(pPolyHb)的制备  38
    2.3 全血的采集  38
    2.4 化学发光的检测  38
      2.4.1 Luminol-H_2O_2-HRP化学发光反应系统  38
      2.4.2 细菌刺激大鼠全血化学发光反应系统  38
    2.5 温度的设定  38-39
    2.6 化学发光条件的优化  39
      2.6.1 化学发光反应缓冲液的选择  39
      2.6.2 H_2O_2浓度的选择  39
      2.6.3 HRP稀释液的选择  39
    2.7 MEM对化学发光的影响  39
    2.8 肝素对化学发光的影响  39
    2.9 血红蛋白对Luminol—H_2O_2—HRP化学发光反应系统的影响  39-40
      2.9.1 单体血红蛋白(pFreeHb)的影响  39-40
      2.9.2 聚合血红蛋白(pPolyHb)的影响  40
    2.10 细菌刺激全血化学发光反应系统  40
    2.11 血红蛋白对细菌刺激大鼠全血产生化学发光的影响  40
      2.11.1 单体血红蛋白的影响  40
      2.11.2 聚合血红蛋白的影响  40
        2.11.2.1 不同浓度聚合血红蛋白的影响  40
        2.11.2.2 不同时间加入聚合血红蛋白的影响  40
    2.12 细菌的培养  40-41
    2.13 染色  41
      2.13.1 涂片  41
      2.13.2 染色  41
      2.13.3 镜检  41
  3 结果  41-55
    3.1 化学发光条件的优化  41-43
      3.1.1 化学发光缓冲液的选择  41-42
      3.1.2 H_2O_2浓度的选择  42
      3.1.3 HRP稀释液的选择  42-43
    3.2 MEM对Luminol-H_2O_2-HRP化学发光系统的影响  43-44
    3.3 肝素对Luminol-H_2O_2-HRP化学发光系统的影响  44
    3.4 血红蛋白对于Luminol-H_2O_2-HRP化学发光系统的影响  44-46
      3.4.1 单体血红蛋白的影响  44-45
      3.4.2 聚合血红蛋白的影响  45-46
    3.5 细菌刺激全血生物学反应系统  46
    3.6 血红蛋白对细菌刺激大鼠全血产生化学发光的影响  46-49
      3.6.1 单体血红蛋白的影响  47
      3.6.2 聚合血红蛋白的影响  47-49
    3.7 大鼠外周血的杀菌作用  49-50
    3.8 聚合血红蛋白对大鼠外周血杀菌作用的影响  50-52
    3.9 聚合血红蛋白对大鼠外周血中性粒细胞吞噬作用的影响  52-55
  4 讨论  55-60
    4.1 Luminol-H_2O_2-HRP化学发光反应系统的建立  55
    4.2 MEM、肝素及血红蛋白对Luminol-H_2O_2-HRP化学发光反应系统的影响  55-56
    4.3 血红蛋白对细菌刺激大鼠全血生物学反应的影响  56-60
参考文献  60-64
致谢  64

血红蛋白对于细菌刺激大鼠全血中性粒细胞产生生物学反应的影响

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