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热带土壤解磷菌的筛选和种类鉴定及利用的初步评价

作　者: 王义
导　师: 郑服丛
学　校: 海南大学
专　业: 微生物学
关键词: 热带土壤解磷菌 16SrDNA 分子鉴定生防效果
分类号: S154.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

磷是植物生长发育的重要物质基础之一,是植物体内核酸及多种酶、辅酶、ATP等的重要组成成分,这些物质对于细胞来说是至关重要的。作物的生物量和产量与其吸收的磷量呈显著正相关。植物缺磷将导致生长发育迟缓、生长量和产量下降。土壤中的磷总量并不低,但绝大部分处于植物不能直接吸收的状态,致使多数情况下作物缺磷而生长发育和产量受到限制。解磷菌是一类能将植物难以吸收利用的磷转化为植物可吸收利用的磷的微生物。利用微生物的解磷作用弥补土壤磷素营养的不足是当前国内外非常关注的研究课题。本研究建立了解磷菌的筛选体系,利用筛选体系从采自海南、云南和广东等热带气候的土壤中筛选得到一批解磷菌,并鉴定了这些解磷菌株的种类、研究了其解磷能力、生物学特性和生防效果。主要研究结果如下:1、建立起效率比较高的解磷菌初筛体系。以有机磷细菌培养基和无机磷细菌培养为基本培养基,利用液体培养基进行生物富集,然后通过平板稀释法进行分离筛选,共获得107个菌株,结果表明,以有机磷细菌液体培养基为富集培养基,以无机磷细菌固体培养基为筛选培养基,可以有效的从土壤中分离筛选到解磷菌,初步建立起快速有效筛选解磷菌的体系;固体及液体培养条件下解磷能力的测定结果表明,筛选出的解磷菌有较强的解磷能力,进一步验证了此体系的可行性。2、用上述初筛体系对我国热带气候土壤样品进行初筛,根据溶磷圈法初步判定解磷能力大小,共获得118个溶磷圈大小不一的解磷圈。再对这些菌株进行土壤全磷量的测定(钼蓝比色法),较准确的对初筛解磷菌进行定量测定,对初筛菌株进行复筛。经过初筛和复筛,得到37个解磷能力强的菌株。3、以菌落和生理生化特征以及16SrDNA序列比较分析结果为依据,对上述37个解磷能力强的菌株进行了鉴定。现鉴定PSB3为Burkholderia cepacia,PSB4为Burkholderia sp.,PSB13为Burkholderia sp.:PSB15为Salmonella enterica subsp.;PSB26为Klebsiella sp.;PSB58为Pseudomonas sp.;PSB67为Burkholderia anthina;PSB77为Burkholderia sp.等37个菌。4、以前期筛选的解磷菌为待测菌,以Fusarium oxysporum piperis等15个由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供的常见病原菌为供试菌,用5点接菌法将供试菌株接在PDA平板中央,解磷细菌接于四周,进行对峙试验。结果表明,PSB15等个筛选所得解磷菌对其中一些供菌有不同程度的拮抗效果。并对其中一些拮抗效果较好的进行了拮抗后病原菌菌体形态观察,发现其中一些有较明显的形态畸变,具有植物病害生防的应用潜力。5、对筛选所得效果最好的PSB3、PSB4、PSB13、PSB15、、PSB58、PSB67、PSB77等8个解磷菌株进行了番茄、大豆、小麦、向日葵等4个对磷较敏感的作物的种子发芽实验,结果表明,参试菌株的菌液对参试作物种子都有良好的催芽效果。6、对PSB4、PSB13、PSB26、PSB58、PSB67五个菌株进行了大豆的大棚实验,结果表明,五个菌株对大豆苗期的生长发育和产量都有良好的生长促进作用。且产量都是无菌水对照的2倍左右。对PSB26进行了向日葵的盆栽实验,结果表明,PSB26对向日葵的苗期生长有良好的生长促进作用。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
目录  8-11
1 前言  11-20
  1.1 解磷微生物简介  11-12
  1.2 解磷微生物的种类  12-13
  1.3 解磷微生物的分布  13
  1.4 解磷微生物解磷能力的测定方法  13-14
    1.4.1 钼磷比色法  14
    1.4.2 同位素示踪法(尹瑞龄,1990;王光华等,2005)  14
  1.5 不同解磷菌的解磷能力  14-15
  1.6 解磷微生物解磷机理  15-16
  1.7 解磷微生物的研究应用概况  16-17
    1.7.1 国外解磷微生物研究和利用概况  16
    1.7.2 国内解磷微生物的研究和利用概况  16-17
  1.8 解磷微生物在实际应用中应注意的问题  17
  1.9 解磷微菌研究和利用展望  17-18
  1.10 本研究的目的和意义  18-20
2 材料与方法  20-34
  2.1 仪器设备  20-21
  2.2 实验材料  21-26
    2.2.1 供试土样  21-23
    2.2.2 植物病害病原菌  23-24
    2.2.3 主要试剂及配制  24-25
      2.2.3.1 主要试剂  24
      2.2.3.2 主要试剂的配制  24-25
    2.2.4 培养基  25-26
  2.3 方法  26-34
    2.3.1 土壤解磷细菌分离和土壤解磷细菌筛选方法的建立  26-27
      2.3.1.1 土样处理  26
      2.3.1.2 培养基  26
      2.3.1.3 解磷细菌的分离  26-27
      2.3.1.4 解磷细菌解磷能力的测定  27
    2.3.2 初筛解磷细菌液体培养条件下钼蓝比色法测定溶磷能力  27-28
      2.3.2.1 方法原理  27
      2.3.2.2 标准曲线  27
      2.3.2.3 测定操作  27-28
      2.3.2.4 结果计算  28
    2.3.3 生理生化特性  28-29
      2.3.3.1 革兰氏染色  28-29
      2.3.3.2 VP反应  29
    2.3.4 解磷细菌菌株的分子鉴定  29-31
      2.3.4.1 细菌菌液的制备  29
      2.3.4.2 引物设计  29-30
      2.3.4.3 PCR反应体系及反应条件  30
      2.3.4.4 PCR产物的回收  30
      2.3.4.5 Vector与PCR产物的连接  30-31
    2.3.5 解磷细菌生防效果测定  31-34
      2.3.5.1 解磷细菌对常见病原菌的拮抗效果测定  31
      2.3.5.2 解磷细菌对磷敏感作物发芽的促进作用测定  31-32
      2.3.5.3 解磷细菌对磷敏感作物生长量的作用效果测定  32-34
3 结果与分析  34-61
  3.1 土壤解磷细菌筛选方法的建立和土壤解磷细菌分离  34-38
    3.1.1 土壤解磷细菌筛选方法的建立  34-37
      3.1.1.1 解磷细菌的分离  34-35
      3.1.1.2 解磷细菌解磷能力的测定  35-37
    3.1.2 解磷菌的分离筛选  37-38
  3.2 初筛解磷细菌解磷能力的测定  38-40
    3.2.1 固体培养条件下解磷能力的测定  38-39
    3.2.2 液体培养条件下溶磷能力测定(钼蓝比色法)  39-40
  3.3 生理生化特性  40
  3.4 解磷细菌菌株的分子鉴定  40-49
    3.4.1 PCR产物电泳检测  40-42
    3.4.2 回收产物电泳检测  42-43
    3.4.3 转化子的菌落PCR检测  43-44
    3.4.4 序列分析与系统进化树的构建  44-49
  3.5 解磷细菌生防效果测定结果  49-61
    3.5.1 解磷细菌对常见病原菌的拮抗效果测定  49-52
    3.5.2 解磷细菌对磷敏感作物发芽的促进作用研究  52-56
      3.5.2.1 解磷细菌对番茄的发芽实验  52-53
      3.5.2.2 解磷细菌对黄豆的发芽实验  53-54
      3.5.2.3 解磷细菌对小麦的发芽实验  54-55
      3.5.2.4 解磷细菌对向日葵的发芽实验  55-56
    3.5.3 解磷细菌对磷敏感作物生长量的作用效果测定  56-61
      3.5.3.1 对黄豆的生长量的作用效果测定  56-59
      3.5.3.2 对向日葵的生长量的作用效果测定  59-61
4 讨论  61-64
  4.1 关于土壤解磷细菌分离和筛选方法  61
  4.2 解磷微生物的筛选  61-62
  4.3 关于解磷细菌菌株的种类  62
  4.4 关于解磷细菌对植物病害的生防效果  62-64
    4.4.1 关于解磷细菌对植物常见病原真菌的拮抗能力  62-63
    4.4.2 关于解磷细菌对磷敏感作物生长发育的影响  63-64
5 结论  64-65
6后续工作展望  65-66
参考文献  66-70
发表相关的论文  70-71
附录1 解磷菌溶磷圈的观察  71-77
附录2 解磷细菌对供试病原菌的拮抗抑菌带  77-81
附录3 解磷细菌对供试病原菌的拮抗作用  81-86
附录4 PSB15和PSB67的番茄浸种实验中的同日对照照片  86-88
附录5 PSB3和PSB77的小麦浸种实验中的同日对照照片  88-90
附录6 PSB4、PSB13、PSB58、PSB77浇黄豆与对照同日对照照片  90-93
附录7 解磷细菌16SrDNA PCR产物序列测定结果  93-107
致谢  107

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