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高寒草地优势禾草内生细菌主要生物功能研究

作　者: 王辰月
导　师: 陈秀蓉
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 草地生物多样性
关键词: 高寒草地禾草内生细菌溶磷固氮纤维素分解分泌吲哚乙酸(IAA) 16SrDNA
分类号: S812
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本论文以东祁连山高寒草地6种优势禾草为研究对象,应用传统微生物学试验方法和分子生物学方法相结合的方式,对不同组织器官中的内生细菌进行了分离培养,并分别筛选具有固氮、溶磷、纤维素分解、分泌IAA、拮抗等功能的内生细菌,并用16SrDNA进行了序列分析测定,以对部分功能菌株进行初步鉴定,研究结果如下:1.高寒草地优势禾草内生细菌的分离从高寒草地6种优势禾草中共分离出64株内生细菌。其中,从针茅内分离出内生细菌2株,披碱草内生细菌13株,发草内生细菌9株,洽草内生细菌31株,线叶嵩草内生细菌4株,赖草内生细菌5株。且同种禾草不同组织器官中分离出的内生细菌种类及数量亦有不同。试验中,根内共分离出28种内生细菌,地上部分（茎、叶）共分离出36种内生细菌。2.分解纤维素内生细菌的筛选通过将供试菌株接种于羧甲基纤维素钠平板中,测定纤维素分解圈与菌落直径的比例大小,初步判断内生细菌纤维素分解能力的强弱。试验中共分离得到7株具有纤维素分解能力的内生细菌,（ZG2、PB1、QG9、XC1、LB3、PC3和LXA10）,占供试菌株的10.6%。3.具有IAA分泌能力内生细菌的研究对具有较强的IAA分泌功能的内生细菌（QS3、QG3和QS15）,用其稀释过的培养液浸种后,测定了供试植物种子的发芽势、发芽率、胚根长度等指标,发现供试植物种子的发芽势及发芽率平均提高了5%^-15%,在P<0.05的水平上,菌株QS3与QG3对植物种子的增重及胚根增长的促进作用与菌株QS15相比,具有显著性差异。4.溶磷内生细菌的研究试验中分别进行了溶磷内生细菌溶磷能力的定性及定量测定。并从培养基成分对菌株溶解磷矿粉的影响、不同碳、氮源对菌株溶磷能力的影响、不同菌株对磷矿粉Ⅳ的溶解能力、菌株对不同磷源的溶解能力以及不同培养条件对菌株溶磷能力的影响几个方面对溶磷内生细菌进行了研究。研究发现,菌株QS4在以葡萄糖为唯一碳源时,溶磷能力最强,溶磷量达到5.832μg·mL^-1,菌株QC2在以蔗糖为唯一碳源时,溶磷能力最强,溶磷量达到5.692μg·mL^-1;同一菌株对不同无机磷源的溶解能力亦有所差异,菌株QC2对Ca₃（PO₄）₂的溶解量达到5.692μg·mL^-1;而对磷矿粉Ⅳ的溶磷量为0.279μg·mL^-1;菌株QC2的最优培养条件为蔗糖为10 g·L^-1、（NH₄）₂SO₄为0.05 g·L^-1、pH为8、NaCl为0.5 g·L^-1。5.内生拮抗细菌抑菌效果测定试验采用平板对峙法共筛选出3株具有拮抗能力的内生细菌（LXA10、QS12和ZHA10）,菌株对11种常见植物病原真菌:黄瓜枯萎（Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum）、辣椒立枯丝核（Rhizoctonia solani（pepper strain）uhn Schl）、小麦长蠕孢（Bipolaria sorokiniana）、番茄早疫（Alternaria solani （Ell&Mart） Sorauer）、番茄灰霉（Botrytis cinema）、茄子菌核（Sclerotinia sclerotiorum （egg plant strain）（Lib） De Bary）、马铃薯束梗孢（Stysanus stemonitis）、马铃薯炭疽（Colletotrichum coccodes）、马铃薯干腐病菌1 （Fusarium sulphureum）、马铃薯干腐病菌2（Fusarium spp.2）以及孜然褐色菌（Fusarium solani （mart.）Sacc）的生长具有不同程度的抑制作用。其中,菌株ZHA10对不同病原真菌的平均抑菌率较高,对孜然褐色菌的抑制效果最好,抑菌率达83.22%。菌株LXA10对茄子菌核的抑制效果最好,抑菌率高达92.57%,菌株QS12对辣椒丝核病原菌的抑制效果最好,抑菌率达72.94%。6.内生固氮菌的筛选试验筛选出两株固氮能力较好的菌株（QB3、FB3）,其中,菌株QB3已确定为一株联合固氮菌。7.部分功能内生细菌的16SrDNA鉴定试验中采用16SrDNA的分子生物学方法对部分功能菌株进行了初步鉴定,其中,菌株QG3、QB3、LXA10及QS14分别与Ochrobactrum sp.、Agrobacterium tumefaciens、Bacillus subtilis和Sphingobacterium sp.的同源性为99%,因此,将菌株QG3、QB3、LXA10及QS14初步确定为Ochrobactrum sp.、Agrobacterium tumefaciens、Bacillus subtilis和Sphingobacterium sp.。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-11
第一章绪论  11-20
  前言  11-12
  1. 内生细菌的概念  12
  2. 内生细菌的来源  12
  3. 内生细菌的种类和数量  12-14
  4. 内生细菌研究现状分析  14-16
    4.1 植物内生细菌的生态学研究  14-15
    4.2 植物内生细菌的生物学作用  15-16
  5. 内生细菌的应用前景  16-17
    5.1 内生细菌菌肥  16
    5.2 内生生物杀菌剂  16
    5.3 内生固氮、促生或防病杀虫等多功能植物内生工程菌株的构建  16-17
    5.4 内生细菌功能菌资源库的建立  17
  6. 植物内生细菌研究存在的问题  17-18
    6.1 内生细菌的来源  17
    6.2 内生细菌的分离及鉴定  17
    6.3 植物促生内生细菌的应用  17-18
    6.4 植物内生生防菌的应用  18
  7. 论文的研究目的和研究内容  18-20
第二章高寒草地优势禾草内生细菌的生态分布  20-27
  1. 样区概况  20
  2. 优势禾草的选取及采集  20-21
  3. 试验材料  21
    3.1 培养基  21
    3.2 主要试剂及器材  21
    3.3 革兰氏染色试剂配制  21
  4. 试验方法  21-23
    4.1 植物样品表面消毒  21-22
    4.2 内生细菌的分离  22
    4.3 菌种编号及保存  22
    4.4 菌落形态及部分菌株显微形态观察  22-23
  5. 结果与分析  23-25
    5.1 供试优势禾草的选取  23
    5.2 内生细菌的分离  23-24
    5.3 部分菌落形态及菌株显微形态观察  24-25
  6. 讨论  25-27
    6.1 植物样品表面消毒  25-26
    6.2 内生细菌的数量及种类  26
    6.3 内生细菌形态观察  26-27
第三章不同功能内生细菌的筛选及研究  27-46
  1. 试验材料  27-29
    1.1 培养基  27-28
    1.2 主要试剂及配制  28
    1.3 菌种  28-29
    1.4 主要试验仪器  29
    1.5 植物种子  29
  2. 试验方法  29-34
    2.1 具有纤维素分解能力的内生细菌  29
    2.2 分泌吲哚乙酸(IAA)内生细菌的筛选  29-30
    2.3 溶磷内生细菌的筛选  30-33
    2.4 内生拮抗细菌抑菌能力的测定  33
    2.5 固氮内生细菌  33-34
  3. 结果与分析  34-43
    3.1 具有纤维素分解能力内生细菌  34
    3.2 具有分泌IAA 能力的内生细菌  34-36
    3.3 溶磷内生细菌  36-42
    3.4 内生拮抗细菌抑菌能力的测定  42
    3.5 固氮内生细菌  42-43
  4. 讨论  43-46
    4.1 溶磷内生细菌  43-44
    4.2 具有纤维素分解能力的内生细菌  44
    4.3 具有分泌IAA 能力的内生细菌  44-45
    4.4 内生拮抗细菌抑菌能力的测定  45
    4.5 固氮内生细菌  45-46
第四章部分功能内生细菌的16SrDNA 鉴定  46-52
  1. 试验材料  46
    1.1 培养基  46
    1.2 供试菌株  46
    1.3 主要试剂  46
    1.4 主要仪器  46
  2. 试验方法  46-49
    2.1 DNA 的提取  46-47
    2.2 内生细菌基因组DNA 的检测  47-48
    2.3 16S rDNA 基因序列分析及系统发育学地位  48-49
  3. 结果与分析  49-50
    3.1 内生细菌基因组DNA  49
    3.2 16S rDNA 扩增产物检测  49-50
    3.3 16S rDNA 基因序列分析及系统发育学地位  50
  4. 讨论  50-52
第五章结论  52-54
参考文献  54-60
附图  60-63
附录  63-65
致谢  65-66
导师简介  66-67
个人简介  67

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